Cell eksotisk i Rusland

Cell eksotisk i Rusland

Maria Lagarkova
"Science Firsthand" №4 (75), 2017

Neurale celler differentieret fra iPSC'er og mærket med farvestoffer (i grønt – neuroner, rød glialceller). Fluorescensmikroskopi. Foto forfatter

Da japanske forskere i 2006 lykkedes at vende celleudviklingsprogrammet tilbage og returnere modne celler fra en voksen organisme til "barndom", var dette en af ​​de vigtigste fremskridt inden for biologisk videnskab i de seneste årtier. Forfatteren af ​​teknologien for genetisk omprogrammering af celler S. Yamanaka modtog Nobelprisen i 2012, og en ny æra begyndte i biologiens verden. Produktionsteknologien af ​​iPSCs (inducerede pluripotente stamceller) gjorde det muligt at skabe modeller af sygdomme på et fundamentalt nyt niveau for at skærmlægge stoffer. Det umiddelbare perspektiv er oprettelsen af ​​nye behandlingsformer: Efter korrektion ved metoder til genomisk redigering af patologi i iPSC vil de "korrigerede" celler blive transplanteret til en syg person. Hvad er chancerne for at få succes med dette arbejde? Og hvad er de russiske forskers rolle i gennemførelsen af ​​dette ambitiøse projekt?

Om forfatteren

Maria Andreevna Lagarkova – Tilsvarende medlem af det russiske videnskabsakademi, doktor i biologiske videnskaber, professor i Moskva statsuniversitet. MV Lomonosova (Moskva), chef for Laboratoriet for Cellebiologi fra Det Forbundne Videnskabelige og Kliniske Center for Fysisk-Kemisk Medicin (Moskva). Forfatter og medforfatter af 75 videnskabelige artikler og 6 patenter.

Desværre er der få laboratorier specialiseret i arbejde med stamceller eller iPSC'er i Rusland: to institutter i Novosibirsk Academgorodok og flere laboratorier i Moskva og St. Petersborg. I årenes løb er antallet af specialister, der er behov for, vokset, men det er ikke nok at konkurrere med internationale grupper. Hvis i fysik, Rusland på en eller anden måde "holder mærket", så er vores cellebiologers arbejde med udenlandske kolleger ikke særlig interessant og opfattes snarere som eksotiske. Ruslands erfaring med internationale projekter inden for cellebiologi er et særskilt arbejde fra specifikke forskere. Desuden klarer Rusland at ignorere verdens erfaringer. Så der er mange spørgsmål til den russiske føderale lov om biomedicinske cellulære produkter. For eksempel tillader det ikke anvendelse af foster- og embryonale stamceller som kilde til oprettelse af cellulære produkter – der findes ikke sådanne forbud i USA, Det Forenede Kongerige eller Japan.

Kolonier af iPSC'er farvet med antistoffer mod transkriptionsfaktorerne c-Myc og Nanog. Fluorescensmikroskopi. Foto A. Bogomazova

USA og Japan, der er ledende inden for cellebiologi, har finansielle muligheder og er i stand til at tiltrække intellektuel elite fra hele verden, har allerede påbegyndt kliniske forsøg på de første iPSC-celleprodukter. Intensivt arbejde inden for pluripotente stamceller udføres i Storbritannien, Sverige, Holland og mange andre lande. Selvfølgelig vil vi ikke stå på niveau med Europa, USA og Japan, men nogle af vores videnskabsmænds undersøgelser er ret "på lige fod". Det vigtigste er at gøre en indsats, forstå hvad der sker i den videnskabelige verden, repræsentere dig selv i internationale projekter og ikke dvæle på, at verdensvidenskaben er gået langt frem og se efter de nicher, hvor du kan arbejde produktivt: interessante fænomener, tidligere ukendte mekanismer. Vores laboratorium forsøger at finde lignende nicher, og en af ​​dem er undersøgelsen af ​​de molekylære mekanismer i udviklingen af ​​neurologiske sygdomme, nemlig – ataksierneurodegenerative sygdomme, der påvirker rygmarven og cerebellum, hvilket resulterer i nedsat koordinering af bevægelser.

Return celler til "barndom"

Celler, der udgør en række væv fra en multicellulær organisme, gennemgår mange opdelinger fra tidspunktet for befrugtning af et æg til en persons død. I processen med at udvikle organismen, "cellerne" differentieres "(blive specialiseret), der mister muligheden for transformation til andre specialiserede typer. Normalt er dette en ensrettet proces, der er nedlagt i det genetiske program: en differentieret celle kan ikke blive en stamme igen.

Ideen om epigenetisk regulering af den ensrettet udviklingsproces blev formuleret så langt tilbage som i 1940'erne. K. Waddington, der også foreslog udtrykket "epigenetik" – ændringen i genaktivitet, der ikke påvirker DNA-strukturen. Fremskridt i biologi i de sidste årtier vidner for evnen til effektivt at styre cellens tilstand, ændre dets funktioner og specialisering.

For første gang blev cellerne returneret til "barndom", der blev lavet igen og styret i den rigtige retning ved hjælp af et kompleks af faktorer, i 2006 lykkedes de japanske forskere K. Takahashi og S. Yamanaka, der fik pluripotente celler fra musfibroblaster. Selvfølgelig var disse værker baseret på tidligere undersøgelser af R. Briggs, T. King, J.Gerdon og andre forskere, der har bevist, at overførslen af ​​en celles kerne til en ægfri ægcelle kan føre til en ændring i det genetiske program og begyndelsen af ​​væksten af ​​en ny organisme.

Takahashi og Yamanaka arbejdede sammen med kombinationer af 24 transkriptionsfaktorer, der var involveret i at erhverve og vedligeholde en pluripotent tilstand, og identificerede en kombination af proteinfaktorer Oct4, Sox2, Klf4 og c-Myc (nu kendt som "Yamanaka-cocktail"), hvis udtryk i en somatisk celle fører til dens transformation i pluripotent. Denne proces kaldes "genetisk omprogrammering", og de fundne celler kaldes "inducerede pluripotente stamceller" (iPSc). Reprogrammeringsteknologien viste sig at være universel og gjorde det muligt at opnå iriserende celler fra forskellige typer celler, ikke kun hos mus og mennesker, men også af andre dyr, herunder rotter, hunde og svin.

På jagt efter molekylære mekanismer af ataksi

Hovedproblemet med behandlingen og med undersøgelsen af ​​neurodegenerative sygdomme er, at når de første symptomer optræder, falder antallet af levende, ikke-syge celler så meget, at det i mange tilfælde er umuligt at hjælpe en person, men kun støtte palliative terapi forbliver.Af samme grund er disse sygdomme ikke nemme at studere: Indirekte patientstudier (tomografi, analyser af biologiske væsker) er ikke nok, og i prøver taget efter døden er de nødvendige celler allerede døde – der er praktisk taget intet at studere. For at forstå, hvad der sker med en bestemt patologi på molekyliveau, har vi derfor brug for dyre- og cellemodeller.

For syv år siden blev ph.d.-afhandlinger afsat til at opnå iPSC'er, cellekarakterisering. For tre år siden flyttede disse emner til niveauet for mesterens arbejde, og i dag – til niveauet for bachelorarbejdet.

Ved udviklingen af ​​ataksi er gentagne gentagelser af CAG-tripletet i genet, der koder for glutaminaminosyren, genetisk "skyldig", hvilket forårsager overdreven inkorporering af glutaminrester i nogle proteiner.

I øjeblikket er der 8 typer af sådanne lidelser. Spinocerebellar ataxi type 1 er en sjælden sygdom, og det blev primært studeret på eksemplet af få patienter og delvist på dyremodeller, men trængte ikke ind i de subtile molekylære mekanismer. Vi skaber cellulære modeller af denne sygdom: Vi tager en hudbiopsi fra en patient, omprogrammerer cellerne til iPScs og differentierer dem til Purkinje neuroner cerebellum, som nedbrydes i denne sygdom.

Udviklingen af ​​en teknologisk korrekt Purkinje neuron differentieringsprotokol er vores første opgave, som vi skal løse. Det er vigtigt, at protokollen er reproducerbar og "arbejde" for enhver cellelinie. Den næste opgave er at søge efter molekylære mekanismer af type 1 ataxi ved hjælp af iPScs.

Praktiske anvendelser af iPSC-teknologi: screening kemikalier til lægemiddelopdagelse og korrigerende mutationer efterfulgt af transplantation af "helbrede" humane celler. Af: (Nekrasov et al., 2014)

I sådanne undersøgelser er det nødvendigt at sammenligne syge celler med sunde. Problemet er, at folk ikke er mus af bestemte linjer, og deres individuelle forskelle kan i høj grad forvride billedet. Derfor er det umuligt at sammenligne celler fra en syg og sund person – du skal bruge celler afledt af samme person. For at gøre dette skal du enten "helbrede" de syge celler eller introducere en genetisk mutation i genomet af raske celler.

I tilfælde af type 1-ataksi er den anden mulighed mere hensigtsmæssig: Vi lærte at anvende CRISPR / Cas-metoden til at introducere CAG-gentagelserne i genomet af en sund celle.Denne teknologi er allerede blevet rutinemæssig, og vi sammenligner syge og sunde celler og studerer "adfærd" af RNA-molekyler og proteiner og søger mekanismer til udvikling af sygdommen. Værket går ganske succesfuldt.

For de fleste neurodegenerative sygdomme er effektive terapier endnu ikke blevet udviklet. Dette skyldes forskernes begrænsede adgang til menneskelige nerveceller og manglen på passende model systemer til at studere patogenesen af ​​sygdomme og lægemiddelprøvning.

Neuroner differentieret fra iPSCs. Antibody beta-III tubulin farvning. Fluorescensmikroskopi. Foto forfatter

Søgning og udvikling af nye modeller for sådanne uhelbredelige neurodegenerative sygdomme hos en person, såsom Huntingtons sygdom, er en meget presserende opgave. Den nyudviklede genetiske omprogrammeringsteknologi gør det muligt for let tilgængelige celler (fx hudfibroblaster) at opnå in vitro iPSC'er, som igen kan vokse ubegrænset i kultur og differentiere sig til alle celletyper, herunder neuroner, der er nødvendige for at studere de molekylære mekanismer ved neurodegenerativ udvikling. patologi.

I dag er det sæt af cellelinier, der er oprettet i Cell Biology Laboratory i Federal Research and Clinical Center for Fysisk-Kemisk Medicin fra Federal Medical-Biological Agency (Moskva) en unik platform for at studere Huntingtons sygdom. Det kan bruges til at skabe et højt effektivt system med det formål at analysere sygdommens molekylære mekanismer og finde nye neuroprotektorer ved hjælp af screeningsmetoder med høj gennemløb.

Ipcc for økologer og farmakologer

Et andet arbejdsområde i vores laboratorium er relateret til værker, hvis resultater vil være af praktisk betydning for medicin, selv om det hidtil ikke betyder, at vi i morgen behandler nogen. Det handler om at komme fra iPS-celler pigmentepitel nethinden. Her går vi langs den slagne vej: kliniske forsøg med sådanne celler er allerede begyndt i Japan.

Retinalpigmentepitelet, der er opnået ved differentiering af humane pluripotente stamceller, er en hexagonal celle, der danner tætte cellecellekontakter. Fasekontrastmikroskopi. Scale bar – 100 mikron. Af: (Maksimov, 2012)

Pigmentepitelet er en meget vigtig celle, det er deres død, der i vid udstrækning bestemmer dystrofien af ​​nethinden. De beskytter mod ultraviolet stråling, fagocytiserer (optager) eksfolierende ydre membranskiver af fotoreceptorer, udfører en barrierefunktion mellem nethinden og vaskulære celler, understøtter vandmetabolisme. Som allerede vist forbedrer transplantationen af ​​pigmentepitelceller i forsøgsdyr (herunder aber) signifikant udviklingen i den modellerede sygdom i dem – retinal dystrofi.

Vi har udarbejdet proceduren for at opnå retinalpigmentepitel fra iPSCs, men for at kunne bevæge sig videre er det nødvendigt at samarbejde mellem molekylære og cellebiologer, fysiologer, histologer og operationelle læger. En sådan union er en sjældenhed.

Nu forhandler vi med instituttet for cytologi og genetik af den sibiriske gren af ​​det russiske videnskabsakademi (Novosibirsk), hvor der er en interessant model af hurtigt aldrende OXYS rotter, som blandt andet har et tidligt retinopatidvs. retinal patologi. Måske er denne model velegnet til vores forskning. Vi håber, at vi ikke kun kan finde personer, der vil operere på rotter, men også sjældne,Specialister, der er "truede" i vores tid – histologer og fysiologer, og vi vil lancere et fælles projekt, der har en god chance for at nå kliniske forsøg.

Russiske biologer har ingen tradition for at skabe videnskabelige samarbejder. I USA kommer selv konkurrerende grupper ofte sammen, blinke øjnene for uenighed og indse, at et sådant fælles arbejde vil føre forskning til et nyt niveau. Af hensyn til at nå målet, deler forskere cellekulturer, laboratoriemodeller af sygdomme, udstyr. Vores laboratorium med samarbejdet er meget heldig. I mange år har vi arbejdet sammen med det videnskabelige center for neurologi (korresponderende medlem af det russiske videnskabsakademi S. N. Illarioshkin og hans kolleger), med det russiske videnskabsakademis institut for cytologi (professor E. V. Kaznacheyeva og hendes personale) med flere andre russiske institutter og universiteter. Og selvfølgelig kan man ikke undlade at nævne professor S. L. Kiselev fra Institut for Generelle Genetik ved Det Russiske Videnskabsakademi, takket være hvilket landets første arbejde med menneskelige iPS-celler begyndte og blev gjort.

Organoid i stedet for organ

Cellular og molekylærbiologi er meget modtagelig for "modetrends." For tre år siden var "autophagy" et usædvanligt fashionabelt ord, og mange cellulære processer var forbundet med dette koncept. Tidligere var dette ord "apoptose".Nu er det modigt for os at arbejde med CRISPR / Cas genomet redigering metode og tale om exosomer – små membranvesikler, med hjælp fra hvilke celler "kommunikerer" med hinanden.

Et af disse "fashionable" områder, som vores laboratorium også er involveret i, er oprettelsen af ​​såkaldte organeller, produkter af selvorganisering af en gruppe af pluripotente celler. Hvis i begyndelsen af ​​differentiering er det muligt at give cellerne et skub i den rigtige retning, begynder interaktionsprocesser mellem dem, som betingelsesmæssigt bestemmer "hvor hovedet er og hvor halen er", og begynder at reproducere det embryonale udviklingsprogram. En organoid vokser, en celle masse, der ligner hinanden i dets molekylære og histologiske egenskaber til et eller andet organ.

Den såkaldte "organoid" i hjernen, afledt af inducerede pluripotente stamceller (iPScs). Fasekontrast

For eksempel voksede hollandske forskere fra en enkelt stamcelle en tarmorganoid, der indeholdt flere typer af epithelceller (endokrine, sekretoriske, støttende celletyper), og med sin hjælp studerede, hvordan bakterier interagerer med tarmvæv. Helicobacter pylorisom anses for årsagen til visse sygdomme i mave-tarmkanalen (Dutta & Clevers, 2017). Denne proces er svært at se. in vivo selv på et model dyr, men det er nemt at gøre, når man arbejder med organoider.

I vores laboratorium vokser organets organismer i øjet, såvel som hjernen og cerebellumet, med hjælp som vi planlægger at studere ataxi.

Organoider, produkter af celle-selvorganisering, er i stand til at udføre i det mindste en del af et organs fysiologiske funktion. De består af flere typer celler og bør reproducere de processer, der forekommer under organogenese i en levende organisme i et laboratorium. Organoider kan indsamles ikke kun fra pluripotente celler, men også fra voksne stamceller, og selv fra differentierede celler. På billedet – øjeorganoid, differentieret fra iPSC. Fasekontrast. Foto forfatter

Testrørorganer

En gruppe af Novosibirsk forskere fra Institut for Cytologi og Genetik og Institut for Kemisk Biologi og Grundlæggende Medicin fra den Siberiske Gren af ​​Det Russiske Videnskabsakademi (Novosibirsk), Novosibirsk Forskningsinstitut for Blodcirkulation Patologi. Akademiker E.N. Meshalkina udvikler vævstekniske tilgange til vaskulær regenerativ medicin.

Vaskulære strukturer som følge af den rettede kardiovaskulære differentiering af inducerede pluripotente stamceller. Fluorescensmikroskopi. Af: (Shevchenko, Zakharova, 2014)

Relevansen af ​​dette emne er relateret til det faktum, at antallet af patienter med vaskulær patologi i dag vokser hurtigt, og behandlingen af ​​sådanne sygdomme involverer ofte udskiftning af skibe med autologe (donor) eller syntetiske. Begge disse muligheder har deres begrænsninger, alternativet er brugen af ​​vaskulære vævsteknologiske proteser.

I Novosibirsk blev der udviklet en protokol til opnåelse af specifikke vaskulære celler, der er i stand til at danne blodkar fra et biopsiemateriale såvel som fra humane pluripotente stamceller underkastet retningsdifferentiering. De opnåede vaskulære celler studeres i detaljer ved anvendelse af forskellige funktionelle og molekylære genetiske tests, og derefter befolkes de med syntetiske overflader. Den resulterende vaskulære protese er ens i egenskaber til en naturlig blodkar (Shevchenko, Zakharova, 2014).

Sjældne homozygoter – en chance for iPSC-terapi

Nu er der teknologier og viden, der tillader at bruge iPSCs til at studere patogenesen af ​​sygdomme og til screening af stoffer. Selvom det endnu ikke er kendt, når verdensvidenskaben lærer at redigere genetiske patologier i inducerede pluripotente celler og genplantningsceller hos mennesker.

En sådan tilgang er endnu ikke gennemført, og hvis et gennembrud finder sted, så vil det sandsynligvis være dyrt og langt. Efter alt, kun fra det øjeblik, hvor man tager en biopsi af huden for at opnå en iPSC, passerer flere måneder Hver cellelinje skal fremstilles under standard GMP betingelser (God fremstillingspraksis, god fremstillingspraksis), bestå test for tilstedeværelsen af ​​mutationer og den potentielle evne til at danne tumorer.

Men der er en alternativ tilgang, hvis idé tilhører S. Yamanake: oprettelsen af ​​relativt universelle linjer af iPSCs. Problemet er, at vi har gener og proteiner, der er ansvarlige for vævskompatibilitet (gener større histokompatibilitetskompleks), og hvis de ikke falder sammen under transplantation, udvikler et vævsafstødningssyndrom. Disse gener er meget variable, så hvis du har brug for at transplantere organer (for eksempel knoglemarv) er det så svært at finde en donor.Groft sagt kan hver person i verden blive en donor for kun en person ud af hver 40 tusind. Sandsynligheden for, at histokompatibilitetskompleksets gener er ens blandt søskende, er kun en fjerdedel.

Hver af os har to kopier (allel) gen: vi har en fra vores far og den anden fra vores mor. Men der er mennesker, hvis kopier af de histokompatibilitetskomplekse gener er de samme (dvs. for disse alleler homozygot) er en glad tilfældighed. Materiale fra sådanne donorer er egnet til transplantation (selv af organer, endda iPSc) til enhver person, der har mindst en allel match. Det anslås, at tredive linjer af iPSC'er fra raske homozygote celler er tilstrækkelige til at sikre tilfældigheden ved transplantation af 25-30% af hele befolkningen i Japan og omkring halvtreds procent. Selvfølgelig er der ret sjældne gen alleler, men halvdelen af ​​landet er allerede meget god.

Yamanaka samler en bank af sådanne homozygoter, og flere cellelinjer baseret på dem er allerede blevet oprettet. Det er lettere for japanskerne at samle en sådan base, fordi de har store registre over potentielle knoglemarv donorer med kendte varianter af histokompatibilitetskomplekset.

I Rusland er der praktisk taget ingen fremme af knoglemarv donation, og derfor er donorernes base meget lille. Jeg mener, at det skal udvikles, for det er kun nødvendigt at donere blod (før dette injiceres et lægemiddel intravenøst, på grund af hvilket knoglemarvsceller indtræder i blodet). Dette er en almindelig praksis, for eksempel i Tyskland. Jeg tror, ​​at Rusland vil komme til dette.

Mere end ti år er gået siden opdagelsen af ​​den genetiske omprogrammering af en somatisk celle til en pluripotent tilstand. I år i et magasin New England Journal of Medicine Resultaterne af den første transplantation af celler afledt af iPSC blev offentliggjort i en patient med retinal dystrofi. Tiden vil vise, om celler afledt af iPSC'er (neuroner, insulinproducerende celler osv.) Vil komme ind i den brede kliniske praksis. Ifølge forfatteren af ​​denne artikel – bør.

I Rusland bruger flere videnskabelige grupper iPSC'er til at skabe modeller af sygdomme, herunder neurodegenerative, skabe isogene systemer ved brug af genomiske redigeringsmetoder. En hel del arbejde har været brugt til at ændre struktur og epigenetisk tilstand af kromatin under omprogrammering og differentiering.

I de senere år er der ved hjælp af iPSCs blevet udført mange interessante grundlæggende videnskabelige værker om mekanismerne til at opretholde pluripotency og vævsspecifik differentiering. Dette område er yderst konkurrencedygtigt, men ganske dyrt. Ikke desto mindre viste iPSCs sig at være et praktisk redskab til at studere molekylære mekanismer af sygdomme, organogenese og andre processer.

litteratur
1. Bogomazova A.N., Vasina E.M., Kiselev SL, et al. Genetisk cellereprogrammering: En ny teknologi til grundforskning og praktisk anvendelse // Genetik. 2015. T. 51. Nr. 4. S. 466-478.
2. Illarioshkin S. N. Huntingtons sygdom som model for undersøgelsen af ​​neurodegenerative sygdomme // Bulletin of the National Society for undersøgelsen af ​​Parkinsons sygdom og bevægelsesforstyrrelser. 2016. № 1 s. 3-11.
3. Maksimov V. V., Lagarkova M. A., Kiselev S. L. Gene og celleterapi for sygdomme i øjets retina // Celltransplantologi og vævsteknik. 2012. V. 7. nr. 3. s. 12-20.
4. Nekrasov, E. D., Lebedeva, O. S., Vasina, E. M., et al. Platform til studier af Huntingtons sygdom baseret på inducerede pluripotente stamceller // eksperimentel neurologi. 2012. V. 6. Nr. 4. S. 30-35.
5. Shevchenko I.S., Zakharova A.G.Testrørorganer // Videnskabens første hånd. 2014. T. 55. nr. 1. s. 19-23.


Like this post? Please share to your friends:
Skriv et svar

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: