Cell termometer

Cell termometer

Tatyana Perevyazova, Kandidat i Biologiske Videnskab
Kirill Stasevich
"Science and Life" №3, 2017

Det er svært at forestille sig en mere kendt fysisk mængde end temperatur. Uanset om vi lytter til vejrudsigten, åbner vandhanen og indstiller termometeret for os selv – vi håndterer det overalt. Temperaturen er forbundet med store genstande – med luftmasser, med en pande af vand, med en menneskekrop. Og spørgsmålet om hvordan man måler temperaturen inde i en enkelt levende celle kan virke underlig. Virkelig, hvordan? Og er det nødvendigt? Svarene på disse spørgsmål er givet ved eksperimenter udført på Institut for Teoretisk og Eksperimentel Biofysik af det Russiske Videnskabsakademi sammen med japanske kolleger. Historien om disse eksperimenter og deres resultater vil begynde lidt fra fjernt.

Transformationerne af energi, enten i en kemisk reaktion eller i en slags fysisk proces, ledsages af varmeudslip. I den levende celle af sådanne reaktioner forekommer mange. Her er et eksempel: Den såkaldte ionkoncentrationsgradient dannes normalt på cellulære membraner, når der er nogen ioner (for eksempel Ca2+) på den ene side af membranen er meget, og på den anden – meget lidt.Når det kommer tid til at give et signal til intracellulære biomolekyler eller at kommunikere noget udenfor, til andre celler, åbner en kanal i membranen, hvorigennem ionerne strømmer fra hvor de er mange, hvor de er få; og det er sådan en ionisk bevægelse, der udfører det nødvendige biokemiske og biofysiske arbejde. Akkumuleringen af ​​iongradienten og dens udledning i henhold til fysisk-kemiske love bør ledsages af en stigning i temperaturen, det vil sige membranerne og membranmolekylerne, der betjener det ioniske køkkenarbejde som øjeblikkelige varmekilder. Kan denne varme måles?

Vi ved, at temperaturen er en termodynamisk egenskab, der beskriver tilstanden af ​​et stort antal partikler. Groft sagt, hvis der er mange partikler, og de bevæger sig hurtigt, hvilket betyder, at de har høj energi, så bliver hele systemet varmt. Hvis du bevæger dig langsomt – koldt. Hvad angår cellen, kan det virke som om der er for få partikler der, så vi kan måle deres temperatur.

Faktisk er alt ikke så. Hvis vi for eksempel tager en kubikmikrometer vand (et volumen, der næsten ikke kan skelnes af øjet), så kan vi regne med omkring 30 milliarder molekyler i det.Dette er et stort antal, og systemet med 30 milliarder partikler har selvfølgelig sin egen temperatur. Fysisk teori har længe tilladt de mikrosystemer, der skal beskrives ved hjælp af en temperaturparameter; Værkerne fra grundlæggeren af ​​nonquilibrium-termodynamik, den fremragende videnskabsmand Ilya Prigogine, den belgiske fysiker og fysikkemiker af russisk oprindelse, Nobelprisen i kemi 1977, spillede en vigtig rolle her. Men hvorfor har ingen, indtil for nylig, gjort bevidst forsøg på at måle lokale intracellulære temperatureffekter?

Når vi beskæftiger os med en stor genstand, såsom en kedel med kogende vand, køler vandet ned i det langsomt. Varme akkumuleret af vand kan ikke hurtigt komme ud i luften, fordi vand og luft adfærd varme anderledes. For at beskrive hvad der sker med temperaturen i sådanne systemer, er der et specielt fysisk-matematisk apparat baseret på ligevægtstermodynamik. Men kogekedlen og luften i køkkenet er "store" systemer. Og hvis vi kun har en mikroliter vand eller mindre, en levende celle? Vi har lige sagt, at fra en molekylær synsvinkel er en mikroliter vand et system med et stort antal partikler med sin egen temperatur.Der er imidlertid en vigtig nuance: forestil dig, at der på et sted i cellen opstod en reaktion ledsaget af varmeudslip. Opvarmer det endda miljøet, vil dets partikler mærke varmen kommer til dem? Vil der være en såkaldt temperaturgradient i cellen, når der er to områder i nærheden med forskellige mængder varme og varmen fra den strømmer ind i den anden, så vi kan måle den? Tidligere beregninger antydede, at kraften i varmekilder i en levende celle er for lille til at skabe lokale temperaturgradienter i den. Det vil sige, at lokale temperaturspring forekommer, men ikke så stort, at de påvirker de intracellulære processer.

I de seneste par årtier er det blevet klart, at sådanne termodynamiske beregninger tilsyneladende ikke er anvendelige på mikrosystemer. For eksempel kan elektroniske enheder varme op ganske stærkt, og da de begyndte at undersøge præcis, hvordan computerprocessorer varmer op, viste det sig, at temperaturgradienterne i deres halvledermikro- og nanostrukturer er meget højere, end man kunne forvente. Hvorfor sker det her? Fordi før de ikke tog højde for den komplekse mikrostruktur af mediet af disse halvledere.Det er helt forholdsvis simpelt i en kedel: Selvom vi koger en vanskelig opløsning af salte fra et kemisk synspunkt, er det stadig homogent, og det kan siges, at varmen fordeles over volumen mere eller mindre jævnt. Og hvis vi beskæftiger os med en kompleks organisation, vil varmen i forskellige dele blive fordelt på forskellige måder. Som et eksempel på, hvordan stoffets struktur kan påvirke termisk ledningsevne, kan carbon nanorør gives: termisk ledningsevne langs deres akse er 1750 … 5800 W / (m · K), men hvis varme påføres vinkelret på aksen, vil termisk ledningsevne kun være omkring 0,02 … 0,07 W / (m · K), det vil sige fem størrelsesordener lavere!

Hvis vi ser inde i en levende celle, vil vi finde, at der ikke er en homogen opløsning af proteiner, lipider mv. Vi vil se mange organeller, intracellulære membraner, store molekylære komplekser. At sammenligne edb-processorer med celler vil synes mere logisk, hvis vi sammenligner deres elektrodynamiske egenskaber. Det er kendt, at forskellen mellem elektriske potentialer på plasmamembranen (på grund af fordelingen af ​​ioner på begge sider) er ca. 100 mV.Justeret for tykkelsesforskellen drejer det sig om samme feltstyrke, som findes i nanostrukturer af mikroprocessorer, og i virkeligheden i processorer fører et sådant felt til betydelige termiske virkninger. Hvis der er et sted nær lipidmembranen, er der en varmefrigivelse, så vil den som i processoren ligge her et stykke tid, fordi membranen selv og molekylære komplekser, der flyder nær varmekilden, ikke vil varme op så hurtigt som de gjorde. ville være i en homogen løsning.

Det viser sig, at cellen, på grund af sin komplekse indre struktur, skal bogstaveligt talt fyldes med lokale termiske foci, der nu opstår, nu falmer. Her er det værd at huske på, at kemiske og fysiske reaktioner ikke kun skaber varme selv, men også afhænger af omgivende temperaturforhold: for eksempel er der processer, der går hurtigere i høje grader, og der er andre der tværtimod sænker ved opvarmning. Tydeligvis bør temperaturforskelle mellem forskellige dele af cellen eller mellem cellen selv og dens nærmeste miljø stærkt påvirke cellulær fysiologi. For at kontrollere om det virkelig er,man må ikke kun måle temperaturen inde i en enkelt celle, men også at varme det for at se, hvordan det reagerer – hvis det reagerer overhovedet.

Det var netop det, som kandidaten til fysisk-matematiske videnskaber Vadim Tseeb og hans kolleger fra Institut for Teoretisk og Eksperimentel Biofysik (ITEB) fra Det Russiske Videnskabsakademi lykkedes at gøre med personalet på det japanske universitet Waseda. Deres nanoheater er relativt simpelt. Tag en suspension af aluminium nanopartikler, hvis diameter er ca. 100 nm. I et par sekunder sænkes spidsen (ca. en mikrometerdiameter) af en konventionel glasmikropipette ind i suspensionen. Den vandige suspension går ind i pipettespidsen, som derefter bringes til varmeren: vandet fordamper, og nanopartiklerne forbliver. Derefter bringes pipettepinden endnu tættere på varmeren, så den smelter – som følge heraf forsegles flere aluminium nanopartikler inden i mikropipetten. Generelt kan andre metaller – platin, sølv, guld – fungere som et "fyldstof" til en nanoheater. Valget af aluminium skyldes kun, at nanopartiklerne svagt holder sammen med hinanden.

For at lave en nanoheater, dyppes en mikropipettes tip kort i en slurry af de mindste aluminiumpartikler og bringes derefter til varmeren for at fordampe vand. Efter fjernelse af vandet opvarmes spidsen endnu mere til lodning af de resterende aluminiumpartikler i den. Termosensoren er lavet på lignende måde, kun pipettens spids forsegles først, og derpå hældes et varmefølsomt farvestof ind i det. På billedet i højre hjørne: Færdig nanoheater (til venstre) og termosensor (til højre)

Det er metallet, som vil opvarme cellen, og for at opvarme nanopartiklerne selv, er der brug for en infrarød laser med en bølgelængde på 1064 nm – hverken vand eller glas absorberer sin stråling, så al strålingsenergi går til aluminium. Ved at holde laserstrålen ved nano-spidsens spids, kan du bogstaveligt talt få en stejl temperaturgradient inden for millisekunder – på grund af den lave varmeledningsevne af vand vil al varme blive dannet i nanopartiklerne.

Men dette er en varmelegeme, og hvad er et termometer? Det er konstrueret på en lignende måde og er en forseglet mikropipette med et termosensitivt fluorescerende stof: afhængigt af temperaturen fluorescerer stoffet ved forskellige frekvenser.Når vi bringer spidsen af ​​termometeret til spidsen af ​​varmeren, føler molekylerne i termometerets spids varme og begynder at gløde anderledes. Naturligvis blev varmelegeme og termometer testet først uden celler, i rent vand, og allerede i sådanne foreløbige eksperimenter lykkedes det os at få et interessant resultat. Når nanopartiklerne blev opvarmet til 100 ° C, dukkede en boble af mættet damp på varmeren – med andre ord kogte vandet nær det. Men allerede i en afstand på kun 20 μm faldt temperaturen til 30 ° C, hvorefter den langsomt faldt til 24 ° C. (Til sammenligning: størrelsen af ​​mitokondrier, cellens vigtigste organeller, der producerer energi til den, og hvor der forekommer et stort antal reaktioner, ligger i området fra 0,5 til 10 mikron.) Det er i sådanne tilfælde, at de siger, at der er en stejl temperaturgradient: fordi vand udfører varmen dårligt, så allerede i nanoheaterens umiddelbare nærhed er temperaturen så høj som 70 ° C nedenfor. Og selvom laser vedligeholder en temperatur på 100 ° C på nanopartikler hele tiden, vil temperaturgraden ikke gå overalt.

Laserstråle ved hjælp af et komplekst optisk system giver den ønskede intensitet og fokusering og styrer strålen ved nano-spidsens spids, der ligger ved siden af ​​den eksperimentelle celle.Temperaturændringer registreres ved hjælp af en termosensor: stoffet i spidsen af ​​termosensoren fluorescerer under lysets virkning, naturen af ​​fluorescensen afhænger af omgivelsestemperaturen. På billedet: nanoheater og termosensor nær cellen

Hvorfor taler vi så meget om temperaturgraden? Forestil dig at nanoheateren med 100 ° C ved spidsen nærmede sig cellen. Hun vil selvfølgelig ikke være god til det. Men hendes naboer vil ikke mærke noget alvorligt, i værste fald – nogle grader opvarmning: Graden er stejl, temperaturen falder meget hurtigt, da varmeren bevæger sig væk fra varmeren. Forestil dig nu, at den døde celle var kræft, og dens naboer var normale, sunde. Hvis vi havde en sådan temperaturskalpel i vores hænder, ville det have været muligt at eliminere fokalet for ondartede tumorer fuldstændigt uden at skade de omgivende sunde væv. (Især i betragtning af at tumorer tåler varmetilstanden værre.)

Men før fantasi om anvendelsen af ​​den nye metode, ville det være godt at vide, hvordan eksperimenterne med nanoheater fortsatte. Opsætningen blev testet med humane celler, hvori der blev skabt en temperaturgradient, og selve cellerne fik et farvestof, der var følsomt for indholdet af calciumioner.Som vi husker, er forskellige ioner, herunder calcium, ujævnt fordelt i cellen: specielle proteiner pumper dem ind i visse organeller eller i cytoplasma. Når vi taler om calcium, akkumuleres det i et komplekst system af membranvesikler og rør, der kaldes endoplasmatisk retikulum eller endoplasmatisk retikulum. Det viste sig, at opvarmning og efterfølgende afkøling stimulerer en kraftig frigivelse af calciumioner fra det endoplasmatiske retikulum ind i cytoplasmaen, hvilket fremgår af farven af ​​det calciumfølsomme farvestof, som også flyder i cytoplasmaet.

Frigivelsen af ​​calciumioner fra det endoplasmatiske retikulum ind i cytoplasmaet af celler efter opvarmning og afkøling. På billedet til venstre i tal mærkede celler rød cirkel – nanoheaterens spids I centrum – celler til frigivelse af calcium til højre – celler efter frigivelse af calcium intensiteten af ​​den rødgul farve angiver intensiteten af ​​strømmen af ​​ioner – mest af alt blev calcium frigivet i cytoplasma i celler, der var tæt på varmeapparatet

Dette kan virke som et simpelt eksperiment, og det er ikke klart, hvorfor det var nødvendigt at oprette en nanoheater: hvorfor ikke kun opvarme cellerne i et næringsmedium,mens man kigger på dem gennem et mikroskop? Men for det første, med en generel opvarmning ville cellerne simpelthen flyde ud af mikroskopets fokus på grund af termisk udvidelse af materialerne. Og for det andet opstod frigivelsen af ​​calcium ved en meget meget hurtig afkøling: efter afbrydelse af laseren forsvandt temperaturgradienten på bare millisekunder. Det ville have været umuligt at arrangere et super-hurtigt termisk hoppe simpelthen ved opvarmning af cellekulturen.

Undervejs fandt forskerne, at cellerne skal opvarmes forskelligt afhængigt af mediumets temperatur, og at den svageste opvarmning er nødvendig ved 36,6 ° C. Med andre ord, hvis cellerne lever ved den normale temperatur i menneskekroppen, er de mest følsomme for temperaturudsving; det viser sig, at vores krop er termisk indstillet for at maksimere effektiviteten af ​​Ca2+. Disse resultater, Ceeb og hans japanske kolleger udgivet i 2009 i HFSP Journal.

Et endnu mere interessant resultat af eksperimenter med en nanoheater er, at den kan bruges til at styre cellevæksten. Så hvis der var en "hot spot" ved siden af ​​neuronen, begyndte de neurale processer at vokse i sin retning med en hastighed på omkring 10 mikrometer pr. Minut.Andre typer af celler opførte sig på en lignende måde: at have følt varmen, de bulede i hans retning. Formen af ​​en hvilken som helst celle afhænger af arkitekturen af ​​sit cytoskelet, dannet af flere specielle proteiner. Det blev vist at i neuroner og i andre celler begynder cytoskelettet som reaktion på varme at genopbygge. Alting skete igen under virkningen af ​​en punktlignende ultra-lokal temperaturgradient, som kun kunne oprettes ved hjælp af en nanoheater – i tilfælde af en stor varmekilde ville det simpelthen ikke have været muligt at skabe temperaturforskelle i et volumen, som kan sammenlignes med selve cellens størrelse. Resultaterne af eksperimenter med neuroner blev offentliggjort i 2015 i tidsskriftet Videnskabelige rapporter.

Når termiske effekter på neuronen begynder dets processer at vokse i retning af varmekilden med en utrolig hastighed – ca. 10 mikron pr. Minut. I billeder taget med et konfokal fluorescensmikroskop, gul prik mærket varmekilde, hvis tid svarer til tidspunktet for 0 s. Illustration: Oyama, K., Zeeb, V. et al. Nature Sci. Rep. 5, 16611 (2015)

Det er ikke længere værd at forklare, hvilke udsigter der åbnes for biologi. For det første er det kendthvilken stor rolle for cellen er spillet af transmembrane ioniske potentialer; Vi kan også tilbagekalde mitokondrier, som ved hjælp af strømmen af ​​ioner gennem et specielt membranenzym syntetiserer energimolekyler til cellen og neuroner, der frembringer en nerveimpuls på grund af den ujævne fordeling af ioner på begge sider af cellemembranen. At fungere på cellen med termiske impulser, kan vi lære mere om de mest grundlæggende processer i dens fysiologi. For det andet, hvis varme påvirker cellevækst så meget, er det let at forestille sig, hvordan en sådan nanoheater kan bruges i regenerativ medicin, hvor det ofte er nødvendigt at reparere beskadigede processer i nerveceller eller få cellerne til at vokse i en bestemt retning. Derudover kan temperaturgradienten anvendes i en anden højteknologisk metode – metoden til 3D-udskrivning, hvor de nu aktivt styrer udskrivning med levende celler.

Mikrograf af en neuron; klart synlig er cellelegemet og dets processer, hvorved neuroner danner neurale netværk. Foto: ZEISS Microscopy / CC-BY-2.0

Selvfølgelig ved vi allerede meget om, hvordan temperatur påvirker cellen.Men hidtil er hovedsagelig fysisk-kemiske reaktioner eller helcellekulturer blevet undersøgt. For nylig er metoder, der gør det muligt for en at studere adfærd hos enkelte celler og individuelle molekyler, at blive udviklet aktivt i biologi, så i den forstand er de beskrevne forsøg placeret i biologisk videnskabens forkant. Og da mange termiske virkninger forekommer i cellen meget hurtigt, så er vi ved hjælp af den nye metode kun i stand til at se, hvad der sker under øjeblikkelig opvarmning og øjeblikkelig afkøling af en meget lille mængde af cytoplasma i cellen eller dens omgivelser.

På baggrund af den "nye metode" er det imidlertid nødvendigt at præcisere, at de overraskende data, der for nylig blev offentliggjort på hastigheden af ​​neuronvækst, blev forudset af mange års arbejde. – De første artikler fra Vadim Tseeb og hans kolleger om emnet "nanoheating" blev offentliggjort i videnskabelige tidsskrifter i første halvdel af 2000'erne . Enheden skabt af forskere til pulserende opvarmning af celler viste sig at være relativt billig, og nu hvor det er blevet klart, at det kan give biologi og medicin, vil jeg gerne håbe, at metoden selv og enheden til den vil finde den bredeste anvendelse i moderne videnskab.


Like this post? Please share to your friends:
Skriv et svar

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: