E. coli-celler kunne finde og ødelægge atrazinherbicidet • Vera Bashmakova • Videnskabsnyheder om "Elements" • Genetik

E. coli-celler var i stand til at finde og ødelægge atrazinherbicidet

Atrazins kemiske struktur. Billede fra en.wikipedia.org

Drømmen om enhver videnskabsmand, der beskæftiger sig med syntetisk biologi, er at omprogrammere celler, så de selvstændigt kan udføre komplekse opgaver – for eksempel syntetisere eller omvendt nedbryde nogle stoffer. Gradvist begynder denne drøm at gå i opfyldelse: mutant E. coli-celler blev for nylig oprettet (Escherichia coli), som genkender herbicidet atrazin, flyttes til lokaliseringsstedet og ødelægger det.

Da atrazin ikke har noget at gøre med E. coli, bestod arbejdet af to dele. For det første var det nødvendigt at "lære" bakterierne at genkende atrazin og bevæge sig i retningen (denne bevægelse hedder pseudotaxis, analogt med kemotaxis). For det andet måtte bakterierne få "våbenet til at ødelægge" herbicidet (dvs. de enzymer, der splittede det).

E. coli har et helt system af proteinsensorer til påvisning af forskellige kemikalier – aminosyrer, dipeptider og sukkerarter. I princippet var det muligt at forsøge at "remake" en af ​​sensorerne, så den reagerede på atrazin, men forskerne besluttede at gå den anden vej og "trække" på dette herbicid, ikke proteiner, men RNA-molekyler.

Til dette blev SELEX teknologi brugt.Denne valgmetode vælges fra gigantiske (mere end 1014 medlemmer) biblioteker af RNA-sekvenser, der specifikt og stærkt er bundet til den krævede ligand (sådanne RNA-, DNA- eller proteinsekvenser kaldes aptamerer, se Aptamer). Baseret på den resulterende aptamer er der skabt riboswitches – RNA-sekvenser, som ligandafhængigt regulerer genekspression uden hjælp af proteinkofaktorer. Så er der mange muligheder: Du kan tvinge cellerne til at inkludere et stof, der er fremmed for deres metabolisme, lære dem at bevæge sig i retning af nogle molekyler eller omvendt "løbe væk" fra dem og så videre.

Desværre sker det ofte, at riboswitchen, der er opnået på basis af aptameret med en høj affinitet for liganden, af en eller anden grund viser sig at være "inoperativ" og kan ikke forårsage de nødvendige reaktioner i cellen. Det er ret vanskeligt at forudsige aptamerens "kompetence" i denne sag. Derfor valgte forskerne at få et stort bibliotek af aptamerer med en gennemsnitlig affinitet for atrazin i stedet for at kigge efter en enkelt aptamer med høj affinitet.

Næste – et spørgsmål om teknologi. På grundlag af hvert medlem af dette bibliotek opretter vi en riboswitch og "sy" den til noglefremtrædende gen (i undersøgelsen anvendte genet Chezansvarlig for cellemotilitet E. coli og involveret i processen med kemotaxis i denne bakterie). Transform den mangelfulde Chez (dvs. blottet for dette gen og ude af stand til at bevæge) celler af Escherichia coli ved anvendelse af det opnåede bibliotek af riboswitches og spred dem på miljøet uden atrazin. Hvis riboswitchen virker, så kan cellerne ikke bevæge sig i fravær af atrazin; Derfor vælger vi af alle bakterielle kloner kun immobilier. Efter to cykler af dette valg begynder den anden fase – de udvalgte kloner spredes på onsdag med atrazin. Nu er et tegn på en fungerende riboswitch, tværtimod, blevet mobilitet celler.

Ordningen om at modtage riboswitch. og – ved hjælp af teknikken Selex vi opretter et bibliotek af aptamerer med en gennemsnitlig affinitet for en ligand fra tilfældige RNA-sekvenser og "sy" et gen til hver af dem Chez. b – vi forvandler mangel Chez bakterier under anvendelse af det resulterende bibliotek. vælge stationære kolonier af celler på medium uden atrazin og mobil på medium med atrazin. Billede fra artiklen i diskussion Natur Kemisk Biologi

Som følge heraf får vi et vist antal riboswitches. Man skal vælge den, der fungerer bedst. Til dette lad os "sy" hver især til et specielt demonstrationsgen lacZ. Dette gen består af to dele – transposaseområdet og sekvensen der koder for beta-galactosidase (for mere information om transposaser, se: Planter låne gener fra "genomiske parasitter", Elements, 26. november 2007). Og så – simpelthen: Jo stærkere niveauet af beta-galactosidase i nærværelse af atrazin, desto bedre fungerer riboswitchen i cellen.

Efter at have valgt det bedste af alle riboswitches, besluttede forskerne at finde ud af, hvordan det virker. I en række elegante eksperimenter kunne de vise, at riboswitchens aktivitet er relateret til oversættelse og ikke til transkription. Derudover formåede vi at lave en model af riboswitchens arbejde. Indledningsvis blokeres dets ribosombindingssted ved atrazinbindingsstedet, når der ikke er nogen atrazin. I nærvær af atrazin fjernes denne side imidlertid, RNA "sidder" på ribosomet, og proteinsyntese begynder.

Efter at have fundet ud af hvordan riboswitch virker, gik forskerne videre til anden fase af arbejdet – de skulle finde et enzym, der spalter atrazin. Der var ingen problemer.Dette herbicid har forurenet miljøet i tres år nu, og mange mikroorganismer har lært at ødelægge det. Til dette arbejde brugte forskere et af de velkarakteriserede gener – Atza, som koder for chlorohydrolase, der omdanner atrazin til hydroxyatrazin. Til forskel fra atrazin er hydroxyatrazin et ret fredeligt stof. Dette er ikke et herbicid, og det antages, at det ikke skader menneskers sundhed. Derudover er det meget bedre atrazina adsorberet på jorden. Omdannelsen af ​​atrazin til hydroxyatrazin kan således være nyttig til genopretning af forurenede jordarter.

Nu er det kun at skabe disse "magiske" celler af E. coli, som kunne finde og nedbryde atrazin. Forskere modellerede dem på en sådan måde, at genet Chez (som er ansvarlig for bevægelse og kemotaxis) styres af riboswitchen og virker derfor kun i nærværelse af atrazin. På samme tid genen Atza (spaltning af atrazin) og genet for det grønne fluorescerende protein GFP (det gør cellerne meget mere synlige og gør det også muligt at skelne mutantceller fra de normale) bliver konstant udtrykt.

For at teste hvordan bakterier arbejder, spredte forskerne dem på et atrazinholdigt agarmedium. Mediet blev fremstillet på en sådan måde, at dekomponeringen af ​​atrazin på den dannede vel synlige specifikke pletter.

Efter inkubation natten over dannedes runde kolonier på overfladen af ​​mediet, der bestod af skiftevis lyse og mørke ringe. Undersøgelse af fluorescensen af ​​GFP fandt forskerne, at de lyse ringe er dannet af et stort antal celler, mens de i de mørke områder af cellerne er meget mindre, og at dømme ved pletterne på overfladen af ​​mediet er der mindre atrazin.

Det antages, at disse ringe vises som følger. En gang i et miljø rig på atrazin kryber cellerne i forskellige retninger med en hastighed, der er proportional med dens koncentration. Formet rund koloni. Der er mange celler i det – det betyder, at de hurtigt klarer at nedbryde atrazin, og de har intet at gøre. Derefter lykkes de mest "snedige" af disse celler at krybe yderligere (som følge af, hvor spotdiameteren stiger) og finde nye "atrazine grunde" for sig selv. De resterende celler, som en gang i et beatrazinfri medium, mister ethvert ønske om at bevæge sig, fordi pseudotaxis også forsvinder fra dem, når der ikke er atrazin.Sådan ses et lyst og mørkt område i kolonien. Efter et stykke slutter atrazin i den ydre ring; så migrere cellerne yderligere, med det resultat at nye ringe vises.

Desuden er det værd at bemærke, at kontrolbakterier mangler et gen Atza (det vil sige i stand til at krybe i retning af atrazin, men ikke i stand til at nedbryde det), danner simpelthen runde kolonier uden vekselvirkning af lyse og mørke områder og uden nogen pletter, hvilket indikerer katabolisme af herbicidet.

Kolonier af celler på medium indeholdende atrazin, tændt hvidt (til venstre) og ultraviolet (til højre) lys. op (og) – kolonier af kontrolceller indeholdende Chez styret af en riboswitch men blottet for Atza (det vil sige dem, der er i stand til at finde atrazin, men ikke i stand til at nedbryde det). Ned nedenfor (b) – kolonier af celler indeholdende og Chez og Atza (det vil sige dem der er i stand til at finde og nedbryde atrazin). Det ses, at kontrolcellerne ikke har en veksel af lys og mørke koncentriske ringe inde i kolonien. Billede fra artiklen i diskussion Natur Kemisk Biologi

Alt dette tyder på, at eksperimentet var en succes, og E. coli er i stand til at finde og ødelægge atrazin – hvilket betyder, at der er enorme muligheder for at bekæmpe miljøforurening,så for udviklingen af ​​syntetisk biologi generelt.

Selvfølgelig er mange problemer ikke blevet løst. For eksempel ser E. coli-celler ikke "atrazin i lav koncentration, og kan derfor kun anvendes på ekstremt forurenede steder. Men dette arbejde er kun begyndelsen, og i efterfølgende eksperimenter vil det være muligt at enten "skrue" cellerne. E. Coli til en mere "atrazinochutkogo" tilstand, eller brug en anden slags bakterier. Det er også helt muligt, at det vil være nyttigt at "slukke" mobiliteten af ​​celler, der ikke er i fravær, men tværtimod i tilstedeværelsen af ​​atrazin – så vil de danne kolonier i dens akkumuleringssteder, men hvis de klare det, vil de kravle væk om deres forretning.

Kilde: Joy Sinha, Samuel J. Reyes, Justin P. Gallivan. Omprogrammering af bakterier. // Natur Kemisk Biologi (2010). V. 6. P. 464-470. Doi: 10,1038 / nchembio.369.

Vera Bashmakova


Like this post? Please share to your friends:
Skriv et svar

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: