Forskere har fundet ud af, hvorfor det er svært for bakteriofager at bekæmpe bakteriens immunsystem • Alexander Markov • Videnskabsnyheder om "Elements" • Virologi, Parasitologi, Mikrobiologi, Evolution, Genetik

Forskere har fundet ud af, hvorfor bakteriofager er svært at bekæmpe bakteriens immunsystem.

Fig. 1. Det endeløse arme løb mellem bakteriofag parasitter og deres bakterieofre ligger i centrum for den hurtige udvikling af begge. Billede fra discovermagazine.com

Systemet med arvelig erhvervet immunitet CRISPR-Cas, udbredt i prokaryoter, beskytter sine ejere på en sikker måde mod virus. Men vira, der konstant er muterede, er i stand til hurtigt at overvinde immuniteten af ​​ethvert enkelt offer (nogle gange på mindre end en dag). Som det viste sig, sikres effektiviteten af ​​CRISPR-systemet ved, at forskellige bakterier takket være deres arbejde lærer at genkende viruset i forskellige dele af dets genom. Som følge heraf bliver måderne at beskytte bakterier fra denne virus så forskellige, at ingen punktmutationer hjælper vira til effektivt at tilpasse sig ofrenes kollektive forsvar. Dette bidrager igen til udviklingen af ​​særlige virale gener, som undertrykker CRISPR-systemet som helhed, og bakterier reagerer på dette ved at udvikle nye varianter af CRISPR-systemet – men sådanne ændringer kræver mere tid.

Operationen af ​​CRISPR-Cas-systemet er baseret på det faktum, at et lille fragment, der er skåret fra et fremmed (for eksempel virus) DNA, der har trængt ind i en bakteriecelle, indsættes i et specielt område (CRISPR locus) af bakteriegenomet.Hvert CRISPR-locus indeholder mange sådanne indsatser ("spacers"), som er stykker af arveligt materiale af parasitter (vira, plasmider, mobile elementer). På basis af afstandsstykkerne syntetiseres RNA-molekyler, som er komplementære til en del af parasitgenomet. Disse RNA'er i kombination med Cas-proteiner anvendes derefter til at identificere og neutralisere fremmed DNA med samme nukleotidsekvens. Således, hvis viralt DNA engang trådte ind i cellen, men cellen formåede at overleve og indsatte et stykke af det virale genom i dets kromosom, efterfølgende forsøg det samme vira inficerer denne celle, eller dens efterkommere stoppes hurtigt og effektivt (læseren vil finde en mere detaljeret oversigt over CRISPR-systemet ved hjælp af linkene i slutningen af ​​nyhederne).

Men vira er ikke tilbøjelige til at forblive "det samme" i lang tid. På grund af tilfældige mutationer og udvælgelse kan de omgå immunforsvaret for ofrene. For at en given spacer kan miste sin effektivitet er det nok, at fragmentet af det virale genom, som er komplementært til det, i det mindste lidt ændrer sig. Derfor virusser succesfuldt og undertiden meget hurtigt overvinde den erhvervede immunitet af bakterier på grund af punktmutationer.På den anden side er CRISPR-systemer meget udbredt i prokaryoter og giver tilsyneladende deres ejere en pålidelig beskyttelse. Hvad gør det muligt for disse systemer at konkurrere på lige fod med hurtigt udviklede parasitter?

Genetik og mikrobiologer fra Det Forenede Kongerige, Frankrig og USA har antydet, at et vigtigt bidrag til effektiviteten af ​​CRISPR er skabt af den kendsgerning, at selv genetisk identiske bakterieceller som reaktion på den samme virale infektion indsætter forskellige afstandsstykker i deres genom svarende til forskellige dele af virusgenomet. Som følge heraf erhverver ofrene hurtigt genetisk mangfoldighed, hvilket i høj grad komplicerer virusets evolutionære opgave. Ved at erhverve en punktmutation, der beskytter mod et enkelt spacer, kan vira kun inficere en lille del af ofrenes befolkning. Heldigvis for bakterier kan bakteriofagen ikke på forhånd bestemme, hvilke afstandsstykker en given celle har: Dette bliver kun klart, når det injicerer sit DNA i det, og så vil det være for sent at skifte mening. Derfor er de fleste fag i en polymorf population af ofre dømt til døden, selvom fager i mellemtiden har punktmutationer, der beskytter mod et bestemt spacer.For at beskytte sig mod mange forskellige afstandsstykker på en gang skal faget samtidig erhverve et helt kompleks af nødvendige punktmutationer, hvilket er meget usandsynligt, fordi mutationer er tilfældige.

Testning af disse antagelser blev udført på bakterierne i pyocyanpinden (Pseudomonas aeruginosa) og fag DMS3vir. For det første var forfatterne overbeviste om, at CRISPR-systemet virkelig pålideligt beskytter bakterier mod denne type fag. I populationerne af "vilde" bakterier døde fagene, der blev introduceret af forskerne, helt på bare 5 dage. I kulturer af bakterier med et handicappet CRISPR-system følte vire mere tilpas: i 30 dage, mens forsøget fortsatte, døde vira ikke i nogen af ​​linjerne. I det første tilfælde udviklede alle bakterier, som man kunne forvente, arvelig erhvervet immunitet baseret på CRISPR. Bakterier med et handicappet CRISPR-system udviklede også en vis beskyttelse, men på en anden måde: de har mutationer, som ændrer overfladeproteinreceptoren, hvortil fagen klamrer sig for at inficere en celle. Tilsyneladende viste den anden metode sig for at være mindre effektiv og tillod ikke, at befolkningen fuldstændig kunne slippe af med parasitten, da befolkningen gjorde det med det fungerende CRISPR-system.

Forfatterne understreger, at den fuldstændige udryddelse af vira i vildtypede populationer er et uventet resultat, da det er kendt, at virus i princippet kan omgå CRISPR-immunitet ved anvendelse af punktmutationer. Måske er det hele i mangfoldigheden af ​​afstandsstykkerne dannet af bakterierne inden for hver af de eksperimentelle populationer? Det forhold, at afstandsstykkerne viser sig at være forskellige, har vist sig i tidligere forsøg. Nu var det nødvendigt at bevise, at denne mangfoldighed bidrager til effektiviteten af ​​et kollektivt immunforsvar. For at gøre dette er det nødvendigt at sammenligne modstanden mod vira i befolkninger med forskellige niveauer af forskelligheder i afstandsstykker.

For at opnå sådanne populationer tog forfatterne deres eksperimentelle linjer, der besejrede virusserne ved hjælp af CRISPR, og isolerede 48 individuelle kloner fra dem (det vil sige, tog 48 individuelle celler og opnåede mange afkom fra hver). Forskerne forventede (og disse forventninger blev senere bekræftet) at afstanden mellem alle eller næsten alle kloner ville være anderledes. Derefter var disse kloner sammensat af fem typer af populationer, der var forskellige i niveauet for genetisk mangfoldighed: populationer fra en klon (monokultur) og blandede populationer bestående af 6, 12, 24 og 48 kloner.

Disse populationer blev derefter inficeret med vira. Denne gang var forskerne primært interesserede i udviklingen af ​​vira, nemlig deres evne til at overvinde ofrenes immunforsvar. Derfor varede observationer kun 3 dage – nok tid til mærkbare evolutionære forandringer i vira, men ikke nok til eksperimentelle bakteriepopulationer til at skabe nye afstandsstykker for at tilpasse sig niveauet for genetisk mangfoldighed.

Resultaterne bekræftede forfatterens forventninger. I tre dage er vira helt døde i alle befolkningsgrupper af ofre, sammensat af 24 og 48 kloner, og i mange populationer, der består af 12 kloner. I de mindst forskellige populationer bestående af en eller seks kloner overlevede vira i de fleste tilfælde.

Hvert par timer i løbet af dette tre-dages eksperiment blev nogle virus fjernet til detaljeret analyse. Fager blev underkastet fuld genomisk sekventering, og de blev også introduceret i de rene kulturer af hver af de 48 kloner af bakterier for at se, hvornår virusserne lærte at overvinde ofrets immunforsvar.

Det viste sig, at i de virusser, der havde udviklet sig i tre dage i monokulturer af bakterier, blev mutationer i de fleste tilfælde rettet, hvilket gjorde det tilsvarende spacer ineffektivt.Og det skete som regel i den første dag. Kun fem af de 48 monokulturer kunne ikke klare virus. Som det viste sig, udgjorde i tre tilfælde ud af disse fem bakterier ikke en efter en, men to eller flere antivirale afstandsstykker.

I virusser, der udviklede sig i bakteriepopulationer sammensat af 6 og 12 kloner, blev der kun dannet modstandsdygtighed over for en eller anden spacer i få tilfælde. Men de dårlige stipendiater, der måtte udvikle sig i de mest forskelligartede populationer af ofre, sammensat af 24 og 48 kloner, lærte ikke at overvinde beskyttelsen af ​​nogen af ​​de oprindelige kloner (figur 2).

Fig. 2. Den genetiske mangfoldighed af ofre forhindrer vira i at overvinde deres immunforsvar. Figuren viser resultaterne af forsøg på infektion med vira, der udvikler sig sammen med forskellige populationer af bakterier, hver af de 48 oprindelige bakteriekloner. Hver af de fem kolonner svarer til en række eksperimenter med et af de fem niveauer af ofre for ofre (fra venstre mod højre: 1 klon, 6, 12, 24, 48 kloner). I hvert forsøg blev virus til analyse taget efter 0, 16, 24, 40, 48, 64 og 72 timer efter infektion (6 lodrette rækker inde i hver kolonne; nedenunder Signeret tid i dage efter infektion – d.p.i.).Hver batch vira opnået på denne måde blev introduceret i den rene kultur af hver af de 48 kloner af bakterierne, og de så ud til at se om virusserne kunne formere sig (røde firkanter) eller vil dø ud (grønne firkanter). Tykke sorte vandrette linjer gentagelser er opdelt, det vil sige forskellige eksperimentelle populationer med et givet niveau af mangfoldighed. Figuren viser, at i monokulturer af bakterier, vira i de fleste tilfælde på mindre end en dag, lærte at overvinde immunforsvaret; dette var sjældent i populationer af 6 og 12 kloner, aldrig i populationer på 24 og 48 kloner. Figur fra den diskuterede artikel i natur

Årsagen er selvfølgelig ikke, at disse vira har de "korrekte" mutationer med nedsat frekvens. Mutagenese var sandsynligvis den samme for alle vira. Netop i en monokultur giver en enkelt mutation, der giver beskyttelse mod denne spacer, viruset en stor fordel (fordi det giver dig mulighed for at inficere enhver bakterie), og i den polymorfe kultur af 48 kloner vil nøjagtig samme mutation sikre mutantvirus succes kun med 1/48 sandsynlighed. Selvom han er utroligt heldig, og han sprøjter sit DNA i netop en sådan bakterie, fra hvis spacer han nu er beskyttet, vil hans efterkommere igen møde det samme problem.Og det vil kun blive værre, da antallet af den bakterielle klon, der er blevet sårbar, falder. Men sagen kommer normalt ikke engang til dette punkt: Valget støtter praktisk taget ikke punktmutationer i vira, der beskytter mod separate afstandsstykker, og vira dør ud og har aldrig formået at overvinde beskyttelsen af ​​nogen af ​​de 48 kloner.

Disse resultater understøttes af det faktum, at antallet af mutationer, der findes i genomerne af vira, der udviklede sig i ofre-monokulturer, var signifikant højere end for vira, der udviklede sig i blandede kulturer. I det første tilfælde støttede udvælgelsen nyttige mutationer i vira og ikke i anden. Derudover viste det sig, at bakterier fra blandede kulturer ikke erhvervede nye antivirale afstandsstykker i tre dage, mens i monokulturer forekom sådanne afstandsstykker. Dette er også logisk: i blandede kulturer forekom virus, der var farlige for bakterier, og i monokulturer optrådte vira, der trængte igennem det gamle forsvar, og CRISPR-systemet skabte yderligere afstandsstykker.

Således udgør diversiteten af ​​afstandsstykker, der genereres af CRISPR-systemet, et vigtigt bidrag til dets effektivitet. Hvis systemet reagerede på hver infektion ved at skabe det samme spacer i alle bakterier, ville vira nemt kunne klare sådan et immunsystem.Men da afstandsstykker hver gang er forskellige, bliver punktmutationer og -valg en utilstrækkelig effektiv evolutionær strategi for virus.

Dette forklarer effektiviteten af ​​CRISPR-systemet og dets brede fordeling i prokaryoter. Det er fortsat at forstå, hvorfor bakteriofager endnu ikke er døde, da dette system er så godt. Svaret på dette spørgsmål er dels allerede kendt: for nylig er der fundet særlige gener i fag, der undertrykker CRISPR-systemet som sådan (se: J. Bondy-Denomy et al., 2013. Bakteriofaggener, der inaktiverer CRISPR / Cas-bakterieimmunsystemet). I denne henseende opstår følgende spørgsmål: Hvis der er virale gener, der fuldstændigt deaktiverer CRISPR, hvorfor fik de ikke alle virusserne? Og hvilke bakterier kan modsætte sig disse gener? Svaret på dette spørgsmål er imidlertid også delvis kendt: Der er mange forskellige varianter af CRISPR-systemet, som hver især er sårbare kun for nogle varianter af anti-CRISPR-generne og er beskyttet mod andre. Og at indeholde en flok ekstra gener i dit genom er en dyr fornøjelse for virus, hvis valg normalt støtter komprimeringen af ​​genomet (dette øger reproduktionshastigheden for viruset).

Tilsyneladende fortsætter antagonistisk samudvikling (våbenløbet) mellem fager og bakterier parallelt på forskellige niveauer og på forskellige tidsskalaer.Dannelsen af ​​nye afstandsstykker og frembringelsen af ​​punktmutationer af vira, hvilket gør denne spacer ineffektiv, tager kun få dage eller endog timer. Udviklingen af ​​anti-CRISPR-gener eller nye CRISPR-varianter, der er usynlige over for disse gener, kan tage tusinder og millioner af år (selvom i verden af ​​vira og mikrober, kan alt, hvad der en gang opfandt, hurtigt overføres fra hænder ved vandret overførsel). Slutningen af ​​dette løb er ikke forventet, og det er usandsynligt, at nogen vil komme ud af det som "den endelige vinder". Men kendskabet til dets mekanismer vil gøre det muligt for folk i fremtiden at i det mindste delvist tage kontrol over det.

Kilde: Stineke van Houte, Alice K. E. Ekroth, Jenny M. Broniewski, Hélène Chabas, Ben Ashby, Joseph Bondy-Denomy, Sylvain Gandon, Mike Boots, Steve Paterson, Angus Buckling og Edze R. Westra. De mangfoldighedsfrembringende fordele ved et prokaryotisk adaptivt immunsystem // natur. 2016. DOI: 10,1038 / nature17436.

Se også CRISPR-systemet:
1) Bakterier arver erhvervet immunitet, "Elements", 01/21/2010.
2) Erhvervet immunitet i bakterier kan være forbundet med mekanismerne af RNA interferens, "Elements", 04/06/2011.
3) Det prokaryote immunitetssystem hjælper med at redigere genomet "Elements", 12.03.2013.

På samvolutionen af ​​parasitter og værter:
1) Det er ikke nødvendigt at kæmpe med parasitter, det er muligt at tilpasse sig dem, "Elements", 11.11.2007.
2) Moderne parasitter er farligere end fortid og fremtid, "Elements", 12.12.2007.
3) Myrer forsøger ikke at lugte som larver, der lugter som myrer, Elements, 01/10/2008.
4) Mutant amoebas tillader sig ikke at blive bedraget, "Elements", 10/6/2009
5) Rotiferer gemmes fra parasitter, der flyver til andre reservoirer, "Elements", 2.02.2010.
6) Våbenløbet – Evolutionens motor, "Elements", 1.03.2010.
7) Bakterieinfektion fører til uopretteligt tab af seksuel reproduktion, "Elements", 09.09.2010.
8) En række tropiske insekter opretholdes på grund af den snævre specialisering af parasitter, "Elements", 03/18/2014.
9) En anden forsvarsstrategi fører til et andet evolutionært svar, "Elements", 06/10/2015.

Alexander Markov


Like this post? Please share to your friends:
Skriv et svar

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: