Katalytisk RNA: et lægemiddel fra præbiologisk liv

Katalytisk RNA: et lægemiddel fra præbiologisk liv

Sydney Altman
"Science first hand" № 3/4 (57/58), 2014

Grundtanken om RNA-verdenskonceptet, som dukkede op i 1960'erne, er simpelt: i de tidlige stadier af præbiologisk udvikling var genstande, der kunne multiplicere og konkurrere om begrænsede ressourcer, separate RNA-molekyler, og senere blev proteiner og DNA blot en tilføjelse, selv om og meget vigtigt, til den generelle strøm af genetisk information. Dette koncept, der oprindeligt grænser op til science fiction, er nu stærkt taget plads i verdensbiologi.

Den vigtigste opdagelse var opdagelsen af ​​RNA's katalytiske egenskaber lavet i laboratoriet af professor S. Altman fra Yale University (USA) i undersøgelsen af ​​enzymet RNAse P (nu kaldes disse enzymkatalysatorer ribozymer). Til opdagelsen af ​​RNA's katalytiske egenskaber modtog Altman sammen med T. Cech Nobelprisen i kemi (1989). Forklaringen af ​​arten af ​​RNase P blev udgangspunktet for at gøre det til et redskab til destruktion af uønsket RNA, for eksempel bakteriel. En sådan behandlingsstrategi lover menneskeheden en sejr i løbet, som stadig blev anset for tabt, mellem nye stoffer og modstand mod dem, hvilke bakterier erhverver.

Om forfatteren

Sydney Altman – Sterling professor i molekylær og cellulær biologi og udviklingsbiologi ved Yale Universitet, professor i kemi ved Yale University (USA), leder af det russisk-amerikanske laboratorium for biomedicinsk kemi ved Institut for Kemisk Biologi og Grundlæggende Medicin fra den sibiriske gren af ​​det russiske videnskabsakademi (Novosibirsk). Vinder af Nobelprisen i Kemi (1989), opnået i fællesskab med T. Cech "for opdagelsen af ​​de katalytiske egenskaber ved RNA".

I dag kan vi observere relikvier, der har overlevet fra de mystiske tider med præbiologisk udvikling – RNA-molekyler, der ikke er involveret i den almindelige overførsel af genetisk information fra DNA til protein, men i helt forskellige ting, der er afgørende for kroppens vitale aktivitet. Selve eksistensen af ​​mange regulatoriske, katalytiske, adapter og strukturelle RNA'er viser, hvordan det tidligste, men alligevel præbiologiske liv kunne være blevet organiseret.

En af disse relikvier i de sidste fyrre år er gået fra en eksotisk biokemisk nysgerrighed til en mulig "panacea" for alle sygdomme. Denne historie viser, hvordan det i en usædvanlig grundforskning virker, at en ny ide pludselig kan fødes,potentielt i stand til at omdanne det vigtigste område af menneskelig aktivitet – medicin. I vores tilfælde er dette objekt RNAse P – et enzym involveret i post-transkriptionelle (dvs. efter læsning fra DNA) modifikationer af RNA.

Om RNA "for dummies"

I overensstemmelse med molekylærbiologiens centrale dogma er "tekst" af arvelig information skrevet i RNA-nukleotidbogstaver (for eksempel … AAAUUGAGAUC …) oversat til en anden tekst i oversættelsesprocessen, skrevet i bogstaver-aminosyrer. Oversættelsen, dvs. proteinsyntese på den kodende RNA-matrix, udføres af ribosomer – specielle cellulære makromolekylære proteinproduktionsmaskiner. Funktionen af ​​ribosomet er umulig uden to yderligere klasser af RNA, der allerede er ikke-kodende: ribosomale RNA (rRNA) og transport RNA (tRNA).

E. coli ribosomer (bakterier Escherichia coli), molekylærbiologiens arbejdshest indeholder tre forskellige rRNA-molekyler, og vi har fire. Så livet virker ikke som skat til biologer, hver af disse rRNA'er E. coli kodet af syv forskellige gener, der ligner hinanden meget; Situationen hos mennesker er omtrent den samme.

Men hvis man ser på tRNA,her er det stadig mere kompliceret: E. coli har 86 gener kodende for tRNA for 20 standard aminosyrer, men en mand med hans 497 nukleare og 22 mitokondrie transport RNA forlader langt bagud. Selvfølgelig er et sådant antal forskellige tRNA'er mere end nok til at kode 20 aminosyrer eller endog 61 triplet-anticodoner. Nogle af forskellene mellem tRNA-molekyler indeholdende samme triplet er kendt for at have en funktionel betydning, og cellen bruger en bestemt type tRNA afhængigt af omstændighederne.

Strukturen af ​​tRNA er ofte afbildet som et "kløverblad". Faktisk er det overraskende, at en sådan relativt kort kæde (de fleste tRNA'er er 75 til 95 nukleotider i længden) kan foldes ind i en struktur indeholdende fire grene, "stammen" og tre sløjfer. På en af ​​løkkerne er placeret antikodonstammen – en tre-nucleotid region, der genkender et kodon kodende for en specifik aminosyre i messenger RNA.

Ud over de vigtigste sløjfer indeholder tRNA også en såkaldt variabel sløjfe, hvis længde tjener som hovedtræk, hvorefter tRNA er opdelt i to grupper: for klasse I-tRNA er den kort (3-5 nucleotider), og for klasse II kan den endda være længere end hovedsløjferne.Acceptorstammen indeholder en kort enkeltstrenget region ved 3'-enden (sædvanligvis 4 nukleotider i længden), der slutter med sekvensen … CCA, som er i stand til at covalent binde en aminosyre til dannelse af aminoacyl-tRNA, hovedblokken af ​​proteinsyntese.

Men sådan et kendt billede med et kløverblad er kun et diagram: Den sande rumlige struktur af tRNA er helt anderledes og ligner mest sandsynligt bogstavet "G" med dimensioner på ~ 6 × 6 nm, hvor antikodonet og 3'-enden af ​​acceptorstammen er så vidt muligt fordelt. .

"Ulovligt" ribozym

Typisk syntetiseres tRNA som et langt precursormolekyle (for eksempel i bakterier, adskilles adskillige tilstødende gener normalt sammen med et RNA-molekyle). Derfor er tRNA i løbet af dets modning skåret fra længere transkripter. Denne proces udføres af enzymet RNase E, men samtidig ved 5'- og 3'-enderne af tRNA-forløberen forbliver et par ekstra nukleotider, og virkningen af ​​andre specifikke nucleaser er nødvendig for deres fjernelse.

Et af disse enzymer, RNase P, er designet til at fjerne nukleotider fra 5'-enden af ​​tRNA-forløberen.Denne nuklease er blevet hovedfokus for arbejdet i mit laboratorium siden begyndelsen af ​​1970'erne, da vi opdagede, at tRNA syntetiseres fra dets forløber RNA. Men selvfølgelig vores vigtigste og uventede opdagelse vedrørende denne nuklease, der blev offentliggjort i 1983 i tidsskriftet Cell, var at detektere de katalytiske egenskaber af dets bestanddel RNA. Med andre ord var enzymet ikke protein, men RNA – nu kaldes sådanne katalysatorer ribozymer.

Enzymet RNase P i alle levende organismer findes i et kompleks med mindst et protein. Ud over katalytisk RNA indeholder et bakterielt enzym kun et protein (RnpA). Af: (Walker Engelke, 2008)

Faktisk virker RNA i RNase P aldrig alene. Det kan katalysere reaktionen in vitro, men i alle levende organismer er den i kombination med mindst et protein og i højere organismer (eukaryotera) Tallet for sidstnævnte når ti. Selvom RNA, selv når det fjerner proteiner, bevarer delvist katalytisk aktivitet, kan den ikke fungere i celler fuldstændigt blottet for en af ​​proteinkomponenterne af RNase P. Det er imidlertid logisk at antage, at alle RNaser P, der kendes i dag, er afledt af en precursor, der kun indeholder RNA,når denne "forfader" eksisterede: i de tidligste evolutionære tider af "RNA-verdenen" eller senere, da proteinsyntese-rørledningen begyndte at erhverve et moderne udseende.

Vores undersøgelser af virkningsmekanismen af ​​RNase P tillod os at etablere minimumskrav til dets substrat. Hvad skal RNA-molekylet se ud, så det kan genkendes og spaltes af dette ribozym?

Utroligt er det ikke nødvendigt med en kløverbladstruktur for dette overhovedet. RNase P spalt effektivt ethvert RNA, der ligner en tRNA-stamme, dvs. den er delvist dobbeltstrenget med en fri enkeltstrenget 3'-ende … RCCA (hvor R er adenin- eller guaninrest). RNase P spalter disse substrater fra 5'-terminalen ved det punkt, hvor det dobbeltstrengede DNA ender og den enkeltstrengede "hale" begynder. Selv hvis vi tager som mål en RNA med en hvilken som helst sekvens, og en anden – komplementær til den – at forsyne den med en RCCA-hale (den såkaldte ydre styresekvens), så vil målet stadig blive opdelt.

Enzymet RNase P er involveret i fjernelsen af ​​nukleotider fra 5'-enden af ​​precursor-tRNA'et, der er placeret ved siden af ​​3'-"halen". Det viste sig imidlertid, at dets arbejde ikke kræver strukturen af ​​et "kløverblad", hvor tRNA normalt er repræsenteret.RNase P spalt effektivt et hvilket som helst RNA, som ligner "stammen" af tRNA, dvs. delvist dobbeltstrenget, med en fri enkeltstrenget 3'-ende. Enzymet spalter disse substrater fra 5'-siden ved det punkt, hvor det dobbeltstrengede DNA ender og den enkeltstrengede hale begynder

Årsagerne til sådan "ulæselighed" følger tydeligt af strukturen af ​​RNase P, som blev afkodet af røntgenanalyse. Ribozym binder substratet hovedsageligt på grund af strukturs overensstemmelse i form af substratet, og specifikke komplementære bindinger dannes kun i området af 3'-enden, hvor den uforanderlige hale er placeret. Desuden er det muligt at anvende selv en kemisk modificeret guide RNA, hvis den kun indeholder de sekvenser der kræves til genkendelse.

I arkæa – unicellulære prokaryoter, som i nogle gener og metaboliske veje er tættere på eukaryoter end til bakterier – for dannelsen af ​​RNase P binder dets RNA til 4-5 proteiner, hvoraf ingen ligner RnpA. I eukaryoter er op til ti proteiner forbundet med katalytisk RNA, hvoraf nogle er homologe med arkaeiske proteiner, mens andre er unikke for eukaryoter. Af: (Walker Engelke, 2008)

Mod stofmisbrug

Forklaringen af ​​substratspecificiteten af ​​RNase P var udgangspunktet for yderligere søgninger. Da vi kan nedbryde næsten ethvert RNA ved hjælp af RNase P, hvorfor skal vi ikke omdanne det til et værktøj til at ødelægge uønsket RNA? Hvis vi for eksempel kunne introducere et eksternt guide-RNA i celler af patogene bakterier, ville deres egen RNase P ødelægge det komplementære cellulære RNA-mål, hvis tab ville være dødeligt for bakterien.

Er det nødvendigt? Den udbredte ukontrollerede anvendelse af antibiotika har ført til en stigning i forekomsten af ​​stofresistente mikrober. En af hovedårsagerne til udseendet er, at bakterier nemt byder på stykker af genetisk materiale (plasmider), som ofte bærer antibiotikaresistensgener. Så hvis et sådant plasmid forekommer i en population af nogle bakterier eller endda i et mikrobielt økosystem bestående af forskellige arter, så bliver alle dets medlemmer meget snart bærere, hvis det relevante antibiotikum er til stede i miljøet. Alle andre bakterieceller vil simpelthen blive udslettet.

Det er nødvendigt at præcisere, at lægemiddelresistens kan udvikle sig af andre grunde i forbindelse med mutationen af ​​målproteinet i lægemidlet, produktion af for meget målprotein fra cellerne samt aktiveringen af ​​de gener, der er ansvarlige for fjernelse af lægemidlet fra kroppen. Generelt er omfanget af problemet med lægemiddelresistens og de risici, der er forbundet med det, enormt. For eksempel observeres former for multidrugresistent tuberkulose, ufølsom over for første linje anti-TB antibiotika (isoniazid og rifampicin) og ansvarlig for 4% nye tilfælde og 20% ​​af sygdomsreagenser over hele verden. Hvis tuberkulosebakterier også har udviklet modstandsdygtighed overfor quinolonantibiotika og andenlinjemedicin – kanamycin mv., Så forårsager de en sygdom med ekstrem stofresistens. Og sådanne tilfælde i verden tæller titusinder årligt. Tilføje, at i Indien, Iran og Italien er der allerede tilfælde af tuberkulose med total narkotikabestandighed, som i princippet ikke er acceptabel for ethvert moderne antibiotikum.

Situationen forbedres ikke, og faktumat udviklingen af ​​et nyt antibiotikum koster millioner af dollars, og medicinalvirksomheder køber ikke op for at bruge disse millioner på at skabe billige lægemidler til en smal gruppe af forbrugere. Patienter, der uden tøven ville have brugt titusindvis af dollars til et kursus af kemoterapi for kræft, forlænge livet i flere måneder, modvilligt betale hundrede dollars til behandling af infektionen.

Præcis hit

Ved at realisere det terapeutiske potentiale i de eksterne guidsekvenser af RNase P begyndte vi at søge en måde at effektivt levere dem til cellerne af bakterier. Til dette formål var styresekvenserne forbundet med specielle peptider (korte proteinfragmenter), som kunne danne et hul i bakteriens cellevæg eller transporteres aktivt i cellen. Vejledningssekvensen i dette tilfælde spiller rollen som en slags "passager".

En anden vigtig beslutning var valget af kemiske egenskaber for styresekvenserne: vi brugte ikke det sædvanlige RNA eller DNA, men den såkaldte morpholino oligonukleotider, hvori der i stedet for carbohydratrestet af ribose eller deoxyribose er en heterocyklisk morpholingruppe.Sådanne konstruktioner er mere stabile i celler og danner strammere komplekser med RNA-mål.

Som mål anvendte vi bakteriel mRNA transskriberet fra gyrA-genet, som koder for DNA-gyrase-enzymet, der er nødvendigt til replikation af bakterier. Inaktivering af DNA-gyrase er dødelig for bakterielle celler. Derfor er gyrase et kendt mål for sådanne vigtige grupper af antibiotika som fluoroquinoloner (for eksempel det nyligt populære antibiotika ciprofloxacin) og aminocoumariner.

GyrA-genet er så konservativt, at det er blevet muligt at oprette en guidesekvens, der er fælles for et antal patogener. I vores laboratorium er de bakteriedræbende egenskaber hos styresekvenserne blevet undersøgt på flere typer bakterier, som enten er patogener eller er modeller af farlige bakterier. I de fleste tilfælde overlevede mindre end 1% af bakterierne ved brug af vores lægemiddel, selv om det må indrømmes, at koncentrationen af ​​lægemidlet var ret høj sammenlignet med arbejdskoncentrationerne af de sædvanlige antibiotika.

Inspireret af den første succes, har vi været opmærksomme på en anden sygdom – malaria. Et af de årsagsmæssige årsager til malaria, Plasmodium falciparum, henviser ikke til bakterier, men til encellulære eukaryoter. Imidlertid observeres også resistens over for mange antimalariale lægemidler i de kliniske isolater af denne parasit. Da vi udviklede en styresekvens for den målrettede spaltning af mRNA'et, der koder for plasmodium-DNA-gyrase, og introducerede det i inficerede røde blodlegemer, standsede parasitten for at vokse. Det føltes imidlertid godt, hvis vi introducerede målretningssekvenserne udviklet til det bakterielle gyrA-gen, dvs. i dette tilfælde blev målmRNA'et specifikt ødelagt P. falciparum.

Mange stoffer med en uheldig skæbne slutter deres karriere på et tidspunkt, hvor de på trods af lovende foreløbige resultater ikke viser nogen aktivitet i en levende organisme. Derfor forsøgte vi i næste fase vores tilgang i en situation tættere på virkeligheden – på purulente sår.

Naturligvis var det for videnskabens skyld ikke mennesker, der led, men laboratoriemus, som blev injiceret i ryggen, og de lavede en suspension af Staphylococcus aureus, et hyppigt årsagsmiddel til humane hudinfektioner i det resulterende sår. Den næste dag blev såret dækket af en speciel gel,indeholdende et morpholino-oligonukleotid rettet mod mRNA'et af bakteriegenet gyr, tidligere velbevist selv at være følsomt over for og resistent over for antibiotikastammer; kontrollen var enten en ikke-specifik sekvens eller normal saltvand. Det viste sig, at sårene helbredes betydeligt hurtigere hos mus behandlet med et aktivt morpholino-oligonukleotid sammenlignet med kontrolgrupperne. Ifølge dataene fra mikroskopi førte behandlingen til en bedre regenerering af epitelet og det modne kollagenlag. Desuden var antallet af bakterier i sårene af sådanne mus også meget mindre. Således blev en streng test af aktivitet i pattedyrkroppen passeret – i hvert fald hos mus.

En behandlingsstrategi baseret på virkningen af ​​RNase P ribozymet lover menneskeheden en sejr i et løb, der indtil nu blev anset for tabt: mellem nye stoffer og modstand mod dem, hvilke bakterier erhverver. Når alt kommer til alt, når udviklingen af ​​et nyt lægemiddel koster 100 millioner dollars, og det tager 10 år at komme fra ideen til apotekets hylde, og bakterierne bliver helt modstandsdygtige over for et eller to år, så er der ingen grund til at gætte om vinderen.

Narkotika, som specifikt kan nedbryde bakteriel RNA, kan drastisk ændre denne situation. Efter at have bekræftet sikkerheden og virkningen af ​​denne gruppe af forbindelser, for eksempel morpholinoligonukleotider forbundet til et specifikt peptid, der er i stand til at komme ind i cellen, kan styresekvensen varieres frit nok ved at sigte det på forskellige vitale patogengener. Eller endda kombinere mål, hvilket gør fremkomsten af ​​narkotikabestandighed næsten umulig. Endelig og for farmakologi er dette snarere undtagelsen end reglen – den samme type stoffer kan virke på bakterier, protozoer og svampe, måske endda vira og visse typer kræftceller. For at gøre dette skal du bare finde en måde at levere stoffet på det rigtige sted.

Hvorfor stole læger stadig på ampicillin, chloroquin og andre arsenaler for mange år siden til behandling af infektioner? Svaret ligger hovedsageligt i det økonomiske plan. Morfolin (og eventuelle andre) målretningssekvenser er faktisk dyrere end traditionelle antibiotika, som er blevet masseproduceret,og farmaceutiske virksomheder er bange for, at patienter og læger vil foretrække at fortsætte med at bruge gamle lægemidler. Dog er forskellen i pris ikke så stor: en dosis kan koste 2-3 dollars mere end en dosis af et regelmæssigt antibiotikum. Terapi baseret på RNase P-målretningssekvenser er effektiv og har færre bivirkninger. Efter vores mening er tiden kommet for at forene indsatsen fra forskere, læger, medicinalfirmaer og staten og investere i en ny teknologi, der vil give enorme fordele for alle.

Forfatteren takker prof., D. B. n. D. Zharkova (ICBFM SB RAS, Novosibirsk) til udarbejdelse af en publikation baseret på et foredrag givet af forfatteren i maj 2014 i Novosibirsk. Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra Den Russiske Føderations regering (2013).

litteratur
1. Vlasov V. V., Vorobyev P. E. RNA's verden: I går og i dag // Science Firsthand. 2012. № 3 (45). S. 40-49.
2. Gorman K., Fayn Maron D. Revolution i verden af ​​RNA // I videnskabens verden. 2014. nr. 6. s. 70-77.
3. Grigorovich S. I starten var RNA? På jagt efter et første livsmolekyle // Videnskab og liv. 2004. № 2.


Like this post? Please share to your friends:
Skriv et svar

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: