LIM-kinase hjælper tumorceller bane vejen i den intercellulære matrix • Dmitry Kiryukhin • Videnskabsnyheder om "Elements" • Molekylærbiologi, Medicin

LIM kinase hjælper tumorceller bane vejen i den intercellulære matrix

Fig. 1. De på hinanden følgende trin i penetrationen af ​​en cancercelle gennem den ekstracellulære matrix. For at penetrere den ekstracellulære matrix ødelægger cellen den ved hjælp af invadopi. I dette billede rød vist ekstracellulær matrix; blå – cellekernen; grøn – actinmikrofilamentnetværk en stjerne markeret af invadopodier. En – celle 3-5 dage efter invasionens start B – Celle 5-7 dage efter invasionens start. Billede fra artiklen: M. Schoumacher, R. Goldman, D. Louvard, D. Vignjevic. Actin, mikrotubuli og vimentin-mellemfilamenter til forlængelse af invadopodi // den Journal of Cell Biology. 2010. V. 189 (3). S. 541-556

Tumormetastase er et komplekst fænomen, for hvilket ikke kun en celle er i stand til at bevæge sig, men også dets evne til at lave sin egen måde, at ødelægge den intercellulære matrix (et komplekst stof, som fylder rummet mellem celler) er vigtigt. Suppression af disse processer kan bruges til at bekæmpe kræft. Arbejdet fra en gruppe forskere fra Storbritannien, udgivet i Journal of Cell Biology, har forskere rapporteret om opdagelsen af ​​LIMK-proteinets rolle i reguleringen af ​​dannelsen af ​​invadopodi, en karakteristisk kræftstruktur, der er ansvarlig for ødelæggelsen af ​​den ekstracellulære matrix.

Cellebevægelse undergår sådanne processer som immunresponset, embryonisk udvikling, regenerering og sårheling.Tab af mobilitetskontrol følger ofte med udviklingen af ​​kræft. Ved at erhverve evnen til at bevæge sig og miste kontakt med omgivende celler kan kræftceller migrere fra tumorstedet og give anledning til metastase. For metastasering til cellerne er det foruden evnen til at bevæge sig nødvendigt at kunne arbejde deres måde og ødelægge den intercellulære matrix. I dette bistås celler af specielle strukturer kaldet invadopodia (Invadopodia), udvækst, hvor proteolytiske enzymer, der bryder ned den ekstracellulære matrix, er lokaliserede (figur 1). Både under cellebevægelse og dannelsen af ​​invadopoder ved kræftceller spiller omlejring af cellerammen (cytoskelet) en afgørende rolle.

Et af de vigtigste cytoskeletale proteiner er actin, et lille globulært protein, der er i stand til at polymerisere og danne lange tråde – actinmikrofilamenter (figur 2). Hvert af disse mikrofilamenter har to ender, der adskiller sig i deres egenskaber: til en (det hedder plus-ende) actinmonomerer slutter sig, og fra den anden (minus-ende) falder de af (dissocieres). Forholdet mellem additionshastighederne og dissociationen af ​​actinmonomerer bestemmer, om filamentet forlænges eller forkortes.Væksten af ​​mikrofilamenter ligger til grund for dannelsen af ​​flade celleudvækst – lamellopodi (Lamellipodia), som cellen smider ud i retning af dens bevægelse. Den nyligt dannede lamelopodi skaber cellulære kontakter med overfladen langs hvilken cellen bevæger sig. Derefter ødelægger det de gamle kontakter med substratet og trækker frem forkant. Cellekontraktion opstår på grund af stressfibriller, som dannes af actinfilamenter og kontraktil protein-myosin. Af princippet svarer denne proces til muskelkontraktion.

Fig. 2. Ordning for regulering af actinmikrofilamentmontering ved anvendelse af cofilin. Friaktinmonomerer kan slutte sig til plus-enden af ​​actinmikrofilamentet og løsne fra minus-enden. Aktivt cofilin binder til actinfilament og skærer det. Cofilin kan også binde til actinmonomerer og holde dem fra indlejring i mikrofilament. En række regulerende proteiner bidrager til dissociationen af ​​cofilin fra actin og fremstiller også actinmonomer til inkorporering i filamentet. Figur fra N. B. Gusevs artikel (2001) i Soros Educational Journal, med ændringer

Cellebevægelse og dannelsen af ​​invadopodies er forbundet med en dynamisk balance mellem ødelæggelsen og samlingen af ​​actinmikrofilamenter, og disse processer i cellen er under tæt kontrol af regulatoriske proteiner. En af dem er cofilin. Det binder sig til actinmikrofilamentet, hvorefter mikrofilamentet opdeles i to dele på bindingsstedet. Som et resultat fremkommer to nye mikrofilamenter, der hver har en plus og minus ende. Det vil sige, cofilin kan bidrage til dannelsen af ​​nye filamenter. På den anden side binder cofilin til actinmonomerer og forhindrer dem i at blive en del af actinfilamentet, hvilket forhindrer dets forlængelse. Følgelig udfører cofilin to modsatte funktioner i cellen: den fremmer både forlængelse og forkortelse af actinfilamenter.

Valget mellem disse to virkninger afhænger af andre proteiner, der interagerer med actin. Hvis cofilin phosphoryleres, mister den sin aktivitet (figur 3). Fosforylering er indførelsen af ​​en phosphorsyre (phosphat) rest i et proteinmolekyle, der forekommer under virkningen af ​​kinaseenzymer. Denne modifikation giver proteinet en yderligere negativ ladning, som påvirker dets egenskaber og evnen til at interagere med andre proteiner.Fosforylering er en af ​​de mest almindelige regulatoriske modifikationer af proteiner. Forskellige kinaser varierer i struktur og i det sæt proteiner, som de kan phosphorylere. De styrer alle metaboliske transformationer af stoffer i cellen, dens opdeling og bevægelse, muskelkontraktion og cellens respons til eksterne stimuli (hormoner, vækstfaktorer).

Et af kinaser phosphorylerende cofilin er LIM-kinase (LIMK; en kinase indeholdende et LIM-domæne, der tillader forskellige proteiner at interagere med hinanden; figur 3). Det er interessant, at det phosphorylerer kun cofilin og adskillige andre beslægtede proteiner. Samtidig styres aktiviteten af ​​kinasen selv af mange signalkaskader, og dette giver evnen til at regulere actin cytoskeletonomlægninger som reaktion på mange eksterne og interne faktorer.

Fig. 3. Ordning af cofilinaktivitetsregulering ved anvendelse af LIM-kinase. I den aktive tilstand cofilin, binding til actin mikrofilamenter, bidrager til deres ødelæggelse. Dette reducerer antallet af stressfibriller, som er ansvarlige for at stramme den bageste kant af cellen under bevægelse. Som følge heraf vil bagkanten af ​​buret trække op langsommere.På den anden side er der med øgningen af ​​actinmikrofilamenter en stigning i de punkter, hvorfra væksten kan fortsætte, hvilket fører til en mere intensiv udstrækning af den fremre kant af den migrerende celle. Fosforylering under virkning af LIM-kinase (LIMK) fører til inaktivering af cofilin. Fosfataserne spalter phosphat (P) -rest fra proteinmolekylet og overfører det tilbage til den aktive tilstand. Figur fra R. Scott & M. Olson (2007) i Journal of Molecular Medicine, med ændringer

En celle, der anvender LIMK og cofilin, kan således regulere længden og mængden af ​​actinmikrofilamenter: En forøgelse af mængden af ​​aktivt (dephosphoryleret) cofilin fører til destabilisering af actincytoskelettet og inaktivt (phosphoryleret) til stabilisering. Balanceret aktivering af cofilin regulerer cellemotilitet og deres evne til at invadere.

En gruppe forskere fra Det Forenede Kongerige studerede molekylære mekanismer for kollektiv invasion af tumorceller. Med denne type invasion flytter cellerne i en koordineret gruppe. De, der går videre, udfører en særlig funktion – de baner vejen i den intercellulære matrix, som efterfølges af alle andre tumorceller. Det var tidligere kendt, at LIMK er involveret i metastaser.Det var imidlertid ikke klart, hvilken proces der er ansvarlig for LIMK – til regulering af tumorcellernes mobilitet eller for ødelæggelsen af ​​den intercellulære matrix.

For at besvare dette spørgsmål brugte forskerne LIM-kinasehæmmeren såvel som kort interfererende RNA (siRNA), som "slukker" genet, der er ansvarligt for syntesen af ​​dette protein i cellen (undertrykker udtrykket af LIMK-genet).

For det første kontrollerede forskerne behovet for en LIMK for en vellykket invasion. De undertrykte udtrykket af kinasegenet i brysttumorceller (MDA-MB-231-cellelinier) ved hjælp af siRNA og så på, hvordan de ville blive inkorporeret i en matrix, der efterligner det intercellulære stof. Det viste sig, at sådanne celler mister deres evne til at invadere. I cellen er der to isoformer af LIMK – LIMK1 og LIMK2. For at undertrykke invasionen var det nødvendigt at slukke begge isoformer samtidigt. Afbrydelse af LIMK med siRNA blev ledsaget af et fald i mængden af ​​phosphoryleret cofilin og polymeriseret actin i cellerne. Dette er i god overensstemmelse med den rolle, som LIMK-kinasen spiller i cellen (figur 3).

Da invasionen kan afhænge af cellernes evne til at bevæge sig, og evnen til at ødelægge den intercellulære matrix, var det interessant at vide, hvilken af ​​disse processer der er reguleret af LIMK.For at teste effekten af ​​LIMK på cellernes evne til at bevæge sig, brugte forskere en test for cellemotilitet (figur 4): celler blev plantet på en petriskål, og da de fyldte hele bunden af ​​koppen blev celler fjernet fra midten og frigjort en cirkel med standarddiameter. I dette tilfælde overflytter cellerne over tid til det tomme rum og gradvist optager det. Kontrolceller (hvor der er en LIMK) og celler, hvori udtrykket af LIMK blev undertrykt, migreret til midten i samme hastighed. Derfor konkluderede forskerne, at LIMK ikke er ansvarlig for bevægelsen af ​​celler. Yderligere forsøg viste, at undertrykkelsen af ​​udtrykket af LIMK ikke forstyrrede cellernes evne til at regulere deres bevægelsesretning. Således udelukket forskerne muligheden for, at LIMK påvirker cellebevægelsen.

Fig. 4. Afbrydelse af LIM-kinase påvirker ikke mobiliteten af ​​brysttumorceller. Cellerne blev sået på en petriskål, og efter at de havde optaget hele området tildelt dem, blev de befriet fra cellerne en cirkel med standarddiameter (til venstre). Efter 24 timer vandrede nogle af cellerne til det ledige rum (til højre), og deres nummer blev brugt til at vurdere cellemigration.Undertrykkelse af udtrykket af LIMK-kinase førte ikke til signifikante ændringer i antallet af celler, som migrerede sammenlignet med kontroller. Figur fra den diskuterede artikel i Cellenbiologiens tidsskrift, med ændringer

Nu var det logisk at antage, at LIMK er involveret i nedbrydningen af ​​den ekstracellulære matrix. Det viste sig, at hvis celler behandles med en LIMK-hæmmer, ødelægger de den ekstracellulære matrix meget værre (sammenlignet med kontrolceller). Forskere har bemærket, at i celler, hvor LIMK blev hæmmet, er dannelsen af ​​invadopoder forstyrret, med hjælp som den ekstracellulære matrix er ødelagt. Årsagen til dette var sandsynligvis den utilstrækkelige stabilisering af actinfilamenterne, der danner ivadopodiumrammen, i fravær af LIMK. Når LIMK-udtryk undertrykkes, er cofilin ikke phosphoryleret og bidrager til ødelæggelsen af ​​actinmikrofilamenter, destabiliserende invadopodierne.

For metastase til kræftceller er det nødvendigt at kunne ødelægge den intercellulære matrix. Denne evne er dog tilstrækkelig til kun at have nogle celler, og resten vil følge dem langs de asfalterede stier. For at fortsætte med at udforske LIMKs funktion i forhold tæt på virkelige modellerede forskere en sådan tumor som følger (figur 5).På en tredimensionel matrix plantede de en kultur bestående af to typer celler – stromaltumor fibroblaster (CAF, cancerassocieret fibroblast, tumorassocierede fibroblaster) og pladekarcinom (SCC; denne type tumor stammer fra epithelceller, såsom hud). SCC'er kan i sig selv ikke ødelægge den cellulære matrix, men de er i stand til at migrere langs de stier, der er lagt af CAF. Hvis en LIMK-hæmmer blev tilsat til et sådant system, invaderede model-tumoren ikke den matrix, som den voksede på.

Fig. 5. Inhibering af LIM-kinase hæmmer invasionen af ​​model tumorceller. På en tredimensionel matrix blev en kultur bestående af stromal fibroblastceller (CAF) og squamouscarcinom (SCC) podet. I kontrol migrerer SCC-celler i matrixen efter CAF (til venstre). Hvis der tilføjes en LIMK-hæmmer (LIMKi) til mediet, forekommer ikke cellen invasion (til højre). Figur fra den diskuterede artikel i Cellenbiologiens tidsskrift, med ændringer

For at finde ud af, hvilke af processerne der fører til metastase – mobilitet eller evnen til at ødelægge den ekstracellulære matrix – blev forstyrret af en LIMK-hæmmer, ændrede forskerne systemet. For det første voksede de CAF celler på matricen, så de kunne gøre bevægelser i den.CAF'erne blev dræbt og fjernet, og SCC-celler blev plantet på den samme matrix og fik lov til at migrere ind i matrixen. I kontrolforsøget flyttede SCC-celler ind i matricen langs stier lagret af CAF. Hvis en inhibitor af LIMK blev tilsat til mediet, når det voksede SCC, forstyrrede dette ikke migrering af SCC-celler i matricen. Heraf følger, at LIMK ikke styrer processen med cellebevægelse i en sådan tumormodel. Hvis LIMK-hæmmeren blev tilsat til mediet, når CAF blev dyrket på matricen, forekom der ikke SCC-invasion. Derfor er LIMK ansvarlig for ødelæggelsen af ​​matrixen af ​​de førende tumorceller. Det påvirker dog ikke kræftcellernes evne til at følge de allerede anlagte stier.

På grundlag af deres eksperimenter fremlagde forfatterne en model i overensstemmelse med hvilken LIMK deltager i dannelsen af ​​invadopodies – specielle celleudvækst ansvarlige for ødelæggelsen af ​​den ekstracellulære matrix. Actin-mikrofilamenter danner en ramme, der understøtter invadopi. LIMK sikrer, at der er en mængde aktivt cofilin, hvor cellen kan lave en forholdsvis stabil actin stillads. Hvis man bruger LIMK-hæmmeren til at undertrykke sin aktivitet, vil mængden af ​​ikke-phosphoryleret cofilin øges,som vil ødelægge actinmikrofilamenter og forhindre dannelsen af ​​invadopodier. Derfor vil invasionen blive blokeret.

Selvfølgelig er processen med dannelse af invadopodi og cellebevægelse kompleks og afhænger af mange faktorer. Balancen mellem phosphorylerede og defosoropolylerede former for cofilin, som understøttes af LIM-kinase, er kun en af ​​dem.

Kræft er ikke en sygdom forårsaget af en mutation: et stort antal lidelser er karakteristiske for kræftceller, som kan være forskellige selv for celler af samme tumor, for ikke at nævne tumorer hos forskellige patienter. I dag er det kendt, at overdreven aktivering af LIMK findes i visse typer maligne tumorer (brystkræft, melanom, prostatacancer). Derfor kan LIMK-studier føre til opdagelsen af ​​nye måder at forebygge metastaser af tumorer.

kilder:
1) Rebecca W. Scott, Steven Hooper, Diane Crighton, Ang Li, Ireen König, Juni Munro, Elisabeth Trivier, Grant Wickman, Pierre Morin, Daniel R. Croft, John Dawson, Laura Machesky, Kurt I. Anderson, Erik A. Sahai, Michael F. Olson. LIM-kinaser er stromaceller ved tumor og tumorassocierede stromaceller // Cellenbiologiens tidsskrift. 2010. V. 191 (1). S. 169-185.
2) N. B. Gusev. Bevægelse af ikke-muskelceller og reorganisering af actinmiljøfilm (PDF, 403,5 Kb) // Soros Educational Journal. 2001. Volumen 7. №7. P. 9-16.
3) Rebecca W. Scott, Michael F. Olson. LIM kinaser: funktion, regulering Journal of Molecular Medicine. 2007. V. 85. P. 555-568.

Dmitry Kiryukhin


Like this post? Please share to your friends:
Skriv et svar

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: