Prokaryotisk immunitetssystem hjælper med at redigere genet • Vera Bashmakova • Videnskabsnyheder om "Elements" • Genetik, Mikrobiologi

Prokaryotisk immunitetssystem hjælper med at redigere genomet

Fig. 1. Modning af crRNA i type I CRISPR system. CRISPR-regionen består af identiske sekvenser på ca. 30 nukleotider i længden (gentagelser), adskilt af forskellige sekvenser, også ca. 30 nukleotider i længden (afstandsstykker). CRISPR plot er grupperet (kassette); Antallet af CRISPR'er i en kassette og antallet af kassetter varierer meget mellem forskellige typer bakterier og arkæer: En arkæa i en enkelt kassette kan have så mange som 300-500 CRISPRs. Replays er forskellige i forskellige typer af prokaryoter; som for afstandsstykker er deres sæt generelt unikt for hver stamme. CRISPR kassetter side ved side med den såkaldte Cas-generder yder et seriøst bidrag til arbejdet i CRISPR-systemet (for flere detaljer, se billedteksten i figur 2). Efter transkription af CRISPR-kassetten skærer et af Cas-proteinerne, CasE-endonukleasen, den resulterende lange umodne RNA-precursor til korte modne crRNA'er; i det resulterende crRNA er de flankerende (ekstreme) regioner det samme og stammer fra gentagelser, og midten er unikt og dannet af en afstandsstykker. Billede fra dias til K. V. Severinovs foredrag ved Vinterskolen med ændringer

Selvom prokaryoter er en af ​​de mest simpelthen organiserede væsener på Jorden (kun virus er enklere), imponerer deres design med sin nåde og perfektion.For nylig har opdagelsen af ​​prokaryotiske CRISPR-systemer, som giver erhvervet immunitet mod virus og plasmider, for nylig i den videnskabelige verden gjort en revolution. Arbejdet i disse systemer og det faktum, at deres undersøgelse kan give til menneskeheden, blev fortalt i hans foredrag hos Konstantin Viktorovich Severinov, Biologisk Videnskabslæge, der blev afholdt på Future Biotech Winter School støttet af RVC, Dynasty Foundation og RFBR.

Mystiske dele af genomet

I slutningen af ​​1980'erne opdagede japanske forskere i løbet af de første forsøg på at sekventere Escherichia coli-genomet noget fantastisk – DNA-segmenter indeholdende flere identiske gentagelser, adskilt af ikke-identiske, unikke segmenter – afstandsstykker (figur 1, 2). Lignende steder begyndte at blive fundet i andre prokaryoter. Efter en række mellemnavne blev de til sidst kaldet CRISPR – Klyngede regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser grupperet ved regulerende kortpalindromiske gentagelser adskilt af huller. De har omkring 40% af bakterierne og næsten alle arkæer.

Fig. 2. Modning af crRNA i type II CRISPR system. Lang umodent forgænger (præ-crRNK) består af skiftende gentagelser (vist sort) og afstandsstykker (vist grøn). Separat syntetiseret ikke-kodende RNA (tracrRNK) Komplementære til afspilningsafsnittet. Det går i forbindelse med gentagelser, hvilket fører til at skære gentagelsesområdet ved hjælp af RNase III i nærværelse af protein Csn1. Dette er første behandlingsfase. I det næste trin afskæres selv de stykker, der endnu ikke er fuldstændigt afklaret, af de resulterende rester, som et resultat af hvilket der opnås et fuldt modnet crRNA. Billede fra artiklen Elitza Deltcheva et al., 2011. RNase III

CRISPR-funktionen har længe været uklar. De praktiske fordele ved CRISPR blev imidlertid opnået uden at forstå deres rolle: da afstandsstykker er unikke for hver stamme, kan de bruges til at identificere stammer; Dette er f.eks. grundlaget for metoden til spoligotypning af mycobacterium tuberculosis, som i vid udstrækning anvendes i epidemiologi for at identificere kilden til patogenet og for at bestemme infektionskilden.

Men hvorfor gør de disse mystiske CRISPR-celler sig selv? At de er så udbredt i den prokaryote verden, betydede, at de gjorde noget meget vigtigt, at næsten alle prokaryoter havde brug for. Men hvad? Ingen vidste det.

Clue kan lure i nukleotidsekvensen af ​​CRISPR, og især i sekvensen af ​​unikke, ikke-gentagne steder – afstandsstykkerne.Desværre gav undersøgelsen af ​​disse korte nukleotidsekvenser op til et bestemt tidspunkt ingen resultater. Det syntes at afstandsstykkerne kode for en slags abracadabra, der ikke svarer til noget, definerer ikke noget og behøver ikke noget.

For omkring ti år siden kom en nysgerrig og mærkelig ting til lys. Det viste sig, at sekvensen af ​​afstandsstykker af denne type prokaryoter mistænkeligt ofte falder sammen med sekvenserne af genomerne af vira, som inficerer denne art. Sådan en utrolig sammenfald foreslog, at CRISPR-systemet er noget af en slags prokaryotisk erhvervet immunitet, der gør det muligt at huske fjenden og klare det, når du geninficerer. Det er behageligt at bemærke, at vores tidligere landsmand Yevgeny Kunin spillede en vigtig rolle i løsningen af ​​CRISPR-funktionen.

CRISPR System: Acquired Prokaryotic Immunity

I øjeblikket er flere typer CRISPR-systemer kendt. Overvej først operationen af ​​CRISPR-systemet, der er karakteristisk for Escherichia coli. Esherichia сoli.

Ved transskribering af en CRISPR-kassette opnås korte ikke-kodende RNA'er – crRNA, der hver består af en spacer omgivet af to repetitionssteder (figur 1).Hvis en celle er inficeret med en virus, hvis DNA-sekvens er komplementær til sekvensen af ​​et af crRNA-afstandsstykkerne, så kan cellen overleve infektionen.

CrRNA-spaceren er forbundet til det komplementære virale DNA-område – protospeaceren ved hjælp af et kompleks af specifikke Cas-proteiner (dette kræver også en kort nukleotidsekvens – PAM, protospacer-associeret motiv) foran protospaceren i det fremmede DNA. Derefter svømmer et andet cas-protein, Cas3, endonuklease / helikase til det resulterende kompleks, som introducerer en dobbeltstrenget pause i virus-DNA'et (figur 3, B). Som følge heraf beskadiges det fremmede DNA, virusinfektionen stopper, og cellen "vinder" og forbliver i live.

Fig. 3. Mekanismen for CRISPR-system type I og II. I systemtypen I (nedenunder) et stort antal komponenter er involveret i skæreprocessen. crRNK binder til et stort hjælpeproteinkompleks kaldet Cascadesom dannes af nogle af cas-proteinerne (generne af proteinerne, der danner dette kompleks, er vist i figur 1 gul). Find en komplementær DNA-sekvens (protospeyser), crRNA ved hjælp af Cascade slutter sig til det; det forårsager enzymaktivering Cas3 (Genet, der koder for det, er vist i figur 1. appelsin), som skærer det fremmede DNA og sparer således cellen. I systemtype II (øverst) mindre komponenter: kompleks tracrRNK-crRNK binder til proto-spacer regionen af ​​det fremmede DNA, og enzymet Cas9 skærer begge strenge af dette DNA med deres HNH- og RuvC-domæner. Bemærk at i begge tilfælde, for at crRNA kan deltage i protospaceren, er der en kort sektion kaldet PAM (protospaser adjancent motiv; i denne figur kaldes det simpelthen motiv). Billede fra Stan J. J. Brouns, 2012. En schweizisk Army Knife of Immunity

Arbejdet med en anden type CRISPR-system, som er karakteristisk for eksempel af bakterier, er også omtrent det samme. Streptococcus thermophilusanvendes til produktion af mange mælkesyreprodukter, men komponenterne i den er mindre og lettere at strukturere. Modningen af ​​crRNA tilvejebringes af et kort ikke-kodende RNA (transaktiverende crRNA eller tracrRNA), et komplementært gentagelsessted og det bredt distribuerede cellulære enzym RNase III (se ribonuclease III) såvel som hjælpeprotein Csn1 (figur 2). Angrebet på fremmed DNA udføres under anvendelse af det samme tracrRNA og endonucleasen Cas9 (fig.3, A).

Det prokaryote CRISPR-virusbeskyttelsessystem ligner meget det eukaryote RNA-interferenssystem, som også deltager i antivirusbeskyttelse og bruger omtrent samme teknik – vedhæftning af en kort komplementær RNA-region til uønsket mRNA og derefter afbrydelse af dette unødvendige mRNA på en eller anden måde. (for eksempel kan du bare klippe det i stykker).

Ofte formår crRNAs at forbinde selv med en ikke-fuldstændig komplementær DNA-sekvens af viruset, forudsat at der findes en egnet PAM-region og begyndelsen protospaceren er fuldstændig komplementær til afstandsekvensen (figur 4). Således kan en afstandsstykker samtidigt beskytte mod flere lignende vira. Dette er praktisk og giver dig mulighed for at spare plads i det lille prokaryote genom.

Fig. 4. Skema for binding af crRNA til fremmed DNA. For denne binding er det nok, at kun den første del af proto-spaceren er komplementær (den hedder frø) og foran protopaceren var der en "korrekt" PAM. Billede fra Semenova et al., 2011. Interferens af klynget regelmæssigt interspaced kort palindromisk gentagelse (CRISPR) RNA styres af en frø sekvens

Men hvad skal man gørehvis cellen aldrig har mødt denne virus før og ikke har crRNA med sin genkendelses spacer? Er hun dømt? Vil virusen virkelig vinde i dette tilfælde?

Ikke ligefrem. Selvfølgelig bcirkaDe fleste af de "naive" bakterier vil blive ødelagt af viruset. Men nogle celler klarer at klare det – og det er sådan (figur 5): Virusinficerede bakterieceller begynder feberligt at skære ud af det DNA, der kom til hånden (eller rettere under enzymet) og indsætte dem i CRISPR-kassetten som afstandsstykker (en vigtig rolle i denne proces spiller to Cas-proteiner – Cas1 og Cas2).

Fig. 5. Den endelige ordning af CRISPR-systemet på eksemplet af bakteriel infektion E. coli fag M13.
1. Det hele starter med det faktum, at fagen angriber en uerfaren bakterie, der ikke tidligere har været udsat for dette patogen og injicerer sit DNA i det. (Figuren viser kun en angrebsfag og kun en ring af dens DNA, der er i cellen, men faktisk er de angrebende fager og det DNA, der er injiceret af dem, meget større.) Som reaktion begynder bakterien ved hjælp af Cas1 / Cas2-proteiner feberagtigt at skæreogalle de DNA-segmenter, der er stødt på – både fag og deres egen, vært – og indsæt dem som spacers i CRISPR.Hvis bakterierne er heldige, og de skærer ud det rigtige stykke phage DNA, så …
2. Infektion vil udløse responsen fra det tilsvarende crRNA, Cascade-komplekset og Cas3 (vist detaljeret i figur 2 og 3), med det resultat at fag-DNA'et vil blive ødelagt. Fager er heller ikke dårligt bagt, de ønsker også at vinde denne krig. Det er værd at mutere fag (vist mutation rød prik), da crRNA vil stoppe med at genkende dem, og de usynlige vil trænge ind i cellen og begynde at gøre deres beskidte arbejde. Det ser ud til, at cellen er dømt, men …
3. Selv et utilstrækkeligt komplementært stykke fag-DNA aktiverer et CRISPR-system, og opskæringen af ​​DNA-fragmenter vil blive fremstillet af fag-DNA. Det er tilsyneladende sikret ved, at Cas1 / Cas2-komplekset, selvom crRNA'et ikke er tilstrækkeligt ufuldstændigt komplementært til fag-DNA'et, begynder at glide langs dette fjendtlige DNA, skar det ud af det ene stykke efter det andet indtil det når den sektion, der er egnet til den "korrekte" rolle. "spacer. Denne spacer gemmer cellen fra infektion.
Billede fra artiklen Kirill A. Datsenko et al., 2012. Molekylær opmærksomhed på CRISPR / Cas adaptive bakterielle immunitetssystem

Bcirkade fleste af de indsatte tomter ville være ubrugelige eller endda skadelige (for eksempelindsættelse som et "portræt af fjenden" -afsnittet af bakterielt DNA vil føre til celledød på grund af raskus eget DNA); Imidlertid indsætter nogle "heldige" et fragment af viralt DNA som et CRISPR spacer, hvilket gør det muligt at syntetisere beskyttende crRNA og besejre virussen. De vil sende denne nye spacer til alle deres efterkommere, og derfor vil deres efterkommere blive beskyttet mod denne virus. Generelt er sæt af afstandsstykker i denne celle på en vis måde dens historie, hukommelsen fra den tidligere, vandt, kæmper med vira.

Men det er ikke alt. Det viser sig, at indsættelsen af ​​afstandsstykker forekommer på princippet om positiv tilbagekobling, dvs. indsættelsen af ​​en afstandsstykker stimulerer kraftigt indsættelsen af ​​efterfølgende afstandsstykker fra donorens DNA. Eksperimenter udført i laboratoriet af K. V. Severinov viste således, at hvis en given bakterie har en spacer for en given virus, forårsager geninfektion med denne virus retningsbestemt indsættelse af yderligere afstandsstykker fra virusets DNA. Med andre ord, hvis bakterien allerede er blevet angrebet af vira før, vil den overføre de næste angreb lettere, fordi den vil have evnen til at identificere fremmed DNA og indsætte nye afstandsstykker. Noget som en vaccination, ikke?

Praktisk anvendelse

Hvilke praktiske fordele kan der udledes af kendskab til driften af ​​et CRISPR-system? Kæmpe, og på en række forskellige områder.

Lad os starte med, at prokaryote celler aktivt anvendes af mennesker til en række ting – tag i det mindste alle kendte mælkebakterier. Det er klart, at en af ​​de mest forfærdelige ting, der kan ske under produktionen af ​​fermenterede mejeriprodukter, er angrebet af bakteriofager, der ødelægger bakteriekulturen. Men hvis vi ved, hvordan vi beskytter bakterierne mod dette angreb, er der ingen problemer med produktionen af ​​mejeriprodukter.

Samtidig kan andre bakterier forårsage alvorlig skade på mennesker, dyr eller planter. Men hvis vi ved, hvordan de beskyttes mod bakteriofagangreb, så kan vi forhindre dem i at gøre det – og så undslippe fra en bakteriel infektion.

Endelig er der en tredje, meget lovende anvendelse af et CRISPR-system. Det kan bruges til at redigere genomerne af højere organismer, herunder mennesker, med hidtil uset nøjagtighed. Dette blev for nylig offentliggjort to artikler i Videnskab (Le Cong et al., 2013. Multiplex Genome Engineering ved anvendelse af CRISPR / Cas-systemer; Prashant Mali et al., 2013. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9), og jeg vil dvæle mere om dette.

Det mest nøjagtige genom saks

For at "redigere" noget sted i DNA'et for at korrigere en mutation, der fører til en genetisk sygdom, skal du førsteat ringe. Samtidig skal skæreenzym-endonukleasen – have den højeste specificitet, dvs. at skære DNA på det rigtige sted og kun i det (fordi skæring af DNA i unødvendig placering kan føre til en helt unødvendig virkninger). Det betyder, at DNA-segmentet, hvorved dette nødvendige sted er genkendt, skal være så længe som muligt – fordi jo længere det er, jo mindre sandsynligt er det, at det samme område vil forekomme et andet sted i genomet, og at endonuclease-sakset også vil passere der.

Og da det beskyttende kompleks af CRISPR-systemer er forbundet med relativt lange (mindst 20 nukleotider) DNA-segmenter svarende til afstandsstykkerne, bliver det muligt at opnå høj specificitet af redigering.

På grundlag af deres udvikling offentliggøres begge grupper af forfattere i Videnskab artikler tog netop arrangeret system fra Streptococcus thermophilusbestående af kun fire obligatoriske elementer – tracrRNA, crRNA, RNase III og Cas9 (figur 3, A). Jo færre komponenterne er, desto lettere er det at arbejde med systemet, og jo større er chancen for, at systemet vil fungere i ikke-standardiserede arbejdsforhold i en eukaryot celle.Forskere formåede at forenkle systemet yderligere. For det første skabte de det "kimære" tracr-crRNA, som virkede ikke værre end tracrRNA og crRNA syntetiseret separat (figur 6). For det andet fandt de, at bakteriel RNase III ikke er nødvendig for at systemet skal fungere, da dets funktion kan udføres af "lokale" RNaser, syntetiseret i en eukaryot celle.

Fig. 6. Et "kimært" RNA har alle nøglefragmenter af crRNA og tracrRNA, der er nødvendige for korrekt funktion i cellen: guidesekvensen (det mest signifikante spacersted, der binder til DNA) og gentagelsesstedet associeret med et stykke tracrRNA. En sådan "kimær" er meget enklere i struktur end to separate molekyler crRNA og tracrRNA og virker omtrent med samme effektivitet. Billede fra artiklen Le Cong et al., 2013. Multiplex Genome Engineering ved hjælp af CRISPR / Cas Systems. Forskere fra den anden gruppe modtog en lignende struktur (Prashant Mali et al., 2013. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9)

Således for ateat sætte DNA'et i cellen på det rigtige sted, måtte du gøre en hel del:

1) Sæt en sekvens komplementær til dette "rette sted" som en spacer i en CRISPR-kassette og få et kimært tracr-crRNA.

2) Kør dette udtrykCRISPR-kassetten og Cas9-proteinet i den tilsvarende celle giver dem et nukleært lokaliseringssignal (NLS), således at de ikke "hænger ubrugeligt" gennem cytoplasmaet, men flyder direkte ind i kernen, hvor faktisk DNA'et, der skæres, er placeret.

Det resulterende system i arbejdet med cellekulturer viste fremragende resultater: med hjælp kan du begge fjerne nogle sektioner fra DNA'et og indsætte nye områder der. CRISPR-systemet viste bedre ydeevne end de tidligere favoritter i dette område – zinkfingre-nukleaser (se Zink finger nuclease) og TALEN. Det er naturligvis umuligt at sige, at CRISPR-systemet vil gøre det muligt for dig at gøre med genomet alt, hvad forskeren ønsker, men måske af alle de eksisterende teknikker, er det tættest på dette.

kilder:
1) Foredrag af K. V. Severinov på FutureBiotech Vinterskole.
2) Le Cong, F. Ann Ran, David Cox et al. Multiplex Genome Engineering ved hjælp af CRISPR / Cas Systems // Videnskab. V. 339, s. 819-823.
3) Prashant Mali, Luhan Yang, Kevin M. Esvelt. RNA-Guidede Human Genome Engineering via Cas9 // Videnskab. V. 339, s. 823-826.
4) John van der Oost. Nyt værktøj til genomisk kirurgi // Videnskab. V. 339, s. 768-770 (synopsis for de to artikler ovenfor).
5) Kirill A. Datsenko, Ksenia Pougach, Anton Tikhonov et al. CRISPR / Cas adaptiv bakteriel immunitetssystem // Naturkommunikation. V. 3. Artikelnummer: 945. Udgivet 10. juli 2012.
6) Ksenia Pougach, Ekaterina Semenova, Ekaterina Bogdanova et al. Transskription, behandling og funktion af CRISPR-kassetter i Escherichia coli // Mol mikrobiol. V. 77. P. 1367-1379.

Vera Bashmakova


Like this post? Please share to your friends:
Skriv et svar

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: