RNA i ekstracellulære vesikler overhovedet ikke som cellulære rester • Dinard Yunusov • Videnskabsnyheder om "Elementer" • Mikrobiologi, Genetik

RNA i ekstracellulære vesikler er slet ikke ligesom cellulære affald

Fig. 1. Fotos af eksosomer (en subpopulation af ekstracellulære vesikler i størrelse fra 30 til 100 nm) efter ultracentrifugering (til venstre) og efter oprensning under anvendelse af en sucrosegradient (til højre, se sidebjælke "Eksosomer af eksemplarisk renhed"). Farvede trekanter indikerer proteinforurening af lægemiddeleksosomer, og umalet – for ekstracellulære vesikler større end 100 nm i størrelse. Et særpræg ved exosomer er den "kopformede" form. Eksosomer blev opnået fra den humane HEK293T-modelcellelinie, som i vid udstrækning anvendes til at studere forskellige aspekter af cellebiologi. Billeder blev taget med et elektronmikroskop ved en forstørrelse på 9300X. Billede fra M.J. Shurtleff et al., 2016. Y-box protein 1

Ekstracellulære vesikler er en forskellig gruppe af små membranvesikler, omgivet af en lipidmembran og indeholdende lipider, proteiner og RNA. I mange år troede forskere, at celler ved hjælp af vesikler slippe af med intracellulære affald, og kun de seneste års opdagelser har gjort det muligt at vurdere potentialet for ekstracellulære vesikler som vigtige bærere af information mellem celler og som midler til at detektere forskellige sygdomme.Men der er ikke enstemmighed blandt forskere om den optimale protokol til isolering af ekstracellulære vesikler eller om deres sammensætning. Det nye arbejde af amerikanske forskere, blandt dem Nobelpristageren Randy Shekman, har enhver chance for at lægge grunden til at forstå præcis hvilke RNA'er der er en del af ekstracellulære vesikler, og hvordan disse RNA'er kommer derhen.

Uden konstant informationsudveksling er det umuligt at forestille sig den koordinerede sameksistens af celler i multicellulære organismer. Betydningen af ​​en sådan udveksling på forskellige niveauer er svært at overvurdere. Det kan forekomme både ved direkte kontakt og gennem frigivelse af forskellige molekyler og membranformationer i det ekstracellulære rum. Den førstnævnte omfatter for eksempel vækstfaktorer og hormoner, og de sidstnævnte ekstracellulære vesikler, som vi ved meget lidt om, og som vil blive diskuteret yderligere.

Det er nu kendt, at ekstracellulære vesikler produceres af alle celler i vores krop uden undtagelse. Disse er små – fra 30 til 5000 nm i størrelse – bobler indeholdende lipider, proteiner og RNA. Indholdet af disse vesikler er omgivet af en dobbeltlags-lipidmembran, som er et derivat af cellemembranen.De første eksperimentelle observationer af ekstracellulære vesikler blev fremstillet i 1946. Derefter blev de opdaget som blodpladepartikler, der bidrager til blodkoagulation. Kun næsten 40 år senere var det muligt at forstå præcis, hvordan disse partikler er dannet. I 1983 blev der observeret, at lignende partikler dannes i de multivesikulære legemer (se multivesikulære legemer eller endosomer) inde i cellerne, når de studerede reticulocytter.

Klassificeringen af ​​ekstracellulære vesikler er baseret på deres oprindelse (og indirekte på størrelse). Exosomer (sædvanligvis fra 30 til 100 nm, figur 1) dannes således kun i multiverse vesikler. Mikrovesikler (mikrovesikler, 100 til 1000 nm) slår simpelthen ud af cellemembranen i det ekstracellulære rum. Apothels (mere end 1000 nm) er dannet cellulære fragmenter som følge af apoptose. I årtier var det fremherskende synspunkt, at for celler er ekstracellulære vesikler bare en måde at slippe af med intracellulære affald. Denne holdning bliver efterhånden en ting fra fortiden. Årsagen til dette er den voksende forståelse af, at lipidmembranen af ​​disse vesikler skjuler (sandsynligvis) funktionelle lipider, proteiner og RNA fra de aggressive enzymer i det intercellulære rum.For mere information om blærer, se artiklen om eksosomer – kroppens flaskepost og kroppens celler kommunikerer ved hjælp af meddelelser pakket i mikrovesikler.

På trods af de forholdsvis store fremskridt i undersøgelsen af ​​ekstracellulære vesikler forbliver mange spørgsmål ubesvarede. For eksempel er der ingen pålidelig måde at adskille eksosomer, mikrovesikler og apotheleter. Det er ikke klart, hvordan ekstracellulære vesikler opfører sig i kroppen, og ikke i cellekulturer. Det forbliver et mysterium præcis, hvilken af ​​komponenterne i ekstracellulære vesikler er ansvarlig for visse reaktioner i cellerne, der modtager disse vesikler, og hvilke mekanismer der er involveret heri. Men hovedopgaven er fortsat at udvikle en klar forståelse af, hvilke RNA, såvel som lipid- og proteinmolekyler overføres af ekstracellulære vesikler og hvordan disse molekyler er inde i vesiklerne.

Ufragmenteret RNA i ekstracellulære vesikler

I et papir, der blev offentliggjort for nylig i tidsskriftet PNAS, forskere fra University of California i Berkeley (fra gruppen af ​​Nobelprispristageren Randy Shekman i 2013 ledet af sig selv, se Nobelprisen i fysiologi eller medicin – 2013, "Elements"10/14/2013) og fra University of Texas i Austin lavede et fælles forsøg på at karakterisere RNA molekyler mest fra ekstracellulære vesikler samt fra en subpopulation af disse vesikler – exosomer indeholdende den klassiske exosomale markør – tetraspanin CD63. Det ser ud til at i denne særlige? Og sandheden er intet (lignende eksperimenter blev udført før), hvis du ikke tager højde for hvilken metode der blev anvendt til RNA-sekventering.

Hvad begyndte du at finde ud af? Først – og dette resultat er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser – de mest talrige var korte ikke-kodende RNA (62%), ribosomalt RNA (rRNA, 27%) og RNA-proteinkodende gener (mRNA, 6,6%) og alle andre biotyper tegnede sig for kun 4,4%. Af det korte ikke-kodende RNA var transport RNA (tRNA, 80% kort RNA) og Y-RNA (14% kort RNA) bedre repræsenteret end andre, mens andelen af ​​microRNA var mindre end 0,5% af alle sekventerede sekvenser (figur 2, A) . Det viste sig også, at RNA-biotyper præsenteres omtrent ens i ekstracellulære vesikler (figur 2, A) og i deres subpopulationer – CD63+-exosomer (figur 2, B). Af denne grund brugte forfatterne i yderligere forsøg kun eksosomer,således koncentrere sig om et mere homogent materiale.

Fig. 2. RNA-biotyper præsenteret i ekstracellulære vesikler (En) og CD63+-exosomer (B). Til venstre alle deekterede RNA-biotyper er vist (Total RNA) og til højre – Biotyper af kun kort ikke-kodende RNA (Small ncRNA). Fra denne figur er det klart, at sammensætningen af ​​CD63 RNA+eksosomer ligner meget ekstracellulære vesikler. Mt-mitokondrie gen transskriptioner, Protein-kodende – proteinkoding, eller messenger RNA (mRNA), Pseudogenpseudogener, rRNAribosomalt RNA, Antisense – langt ikke-kodende RNA, hvis gener overlapper med andre gener på den komplementære DNA-kæde (ikke forveksles med antisense RNA!), lincRNA – langt ikke-kodende RNA fra intergeneriske regioner, sncRNA – kort ikke-kodende RNA; tRNA – transport RNA, Vault RNA – RNA fra Vault organeller, miRNA-miRNA, SnoRNA – Lille nukleolær RNA, SnRNA – Lille Nuclear RNA, Andet snRNA – Andet kort ikke-kodende RNA. I parentes Antallet af gener for hver biotype er angivet. Billede fra artiklen i diskussion PNAS

Overraskelsen var, at det meste af det sekventerede tRNA og andre korte RNA'er var af fuld længde og slet ikke fragmenterede som antaget på grundlag af tidligere offentliggjorte data.Nogen foreslog, at fragmenter af korte RNA'er er nedbrydningsprodukter eller giftige produkter af cellemetabolisme, nogen – at disse er deres nye funktionelle derivater. Det viste sig, at disse fragmenter simpelthen ikke er til stede i ekstracellulære vesikler i nogen væsentlige mængder!

Hvorfor lærer vi os om ufragmenteret RNA i ekstracellulære vesikler lige nu efter mange års forsøg? Og er det muligt, at alle andre var forkerte? Det ligner ja. Hvordan skete der så? Svaret er ret simpelt, men samtidig er det i stand til at producere en lille revolution i tilgangen til sekventerings-RNA, især kort ikke-kodende RNA. Forfatterne af artiklen diskuterede blot spørgsmålet: "Hvad hvis vi sekventielt forkerer alt?".

Pointen er dette. Den nuværende mest populære platform for RNA-sekventering bruger ikke RNA direkte til sekventering. I stedet anvendes komplementært DNA (cDNA), der syntetiseres fra RNA-skabelonen ved hjælp af enzym-revers transkriptase (revers transkriptase). Til gengæld har revers transkriptase en stor ulempe – det læser dårligt RNA-sekvenserne, der er involveret i dannelsen af ​​sekundære strukturer.Ved forhøjede temperaturer ødelægges den sekundære struktur af RNA, men normale revers transkriptaser kan ikke syntetisere cDNA under sådanne betingelser. Vi behøver ikke simpel, men termostabil revers transkriptase.

På grund af deres lille størrelse indeholder de ekstracellulære vesikler næsten ikke lang RNA. Men desværre har korte RNA'er (op til 200 nukleotider i længden), for eksempel tRNA, ofte en meget stabil sekundær struktur og mange ændringer. Dette er vigtigt for deres deltagelse i transport af aminosyrer til ribosomer, men det gør også revers transkription meget vanskelig. Regelmæssig revers transkriptase sådan RNA har ofte ikke råd til. Problemet med revers transkription af RNA med en stabil sekundær struktur blev løst under anvendelse af termostabil revers transkriptase GsI-IIC RT (eller termostabil gruppe II intron revers transkriptase-III, TGIRT-III), og fremgangsmåden til RNA-sekventering blev kaldt TGIRT-seq. Denne metode gjorde det muligt at læse RNA-sekvenser fra begyndelse til slutning, fordi nu den sekundære struktur ikke forårsager ophør af cDNA-syntese.

På trods af brugen af ​​termostabil revers transkriptase bemærkede forskerne, at gruppen af ​​sekvenser af exosomalt tRNA stadig var 15 nukleotider kortere end det fulde længde-tRNA.Da læsningen af ​​RNA under omvendt transkription går fra molekylets ende til begyndelsen, bør stop forekomme i regionen af ​​tRNA kaldet D-sløjfen (D-arm, figur 3, A). Da cDNA-syntese nu blev udført ved forhøjede temperaturer, var den sekundære struktur næppe et problem.

Forskere har antydet, at et sådant stop kan være resultatet af en ændring af RNA's base i denne position. De udnyttede det faktum, at forskellige revers transkriptaser af TGIRT familien skelnes af deres evne til at læse modificerede nukleotider. Når de syntetiserede cDNA med to forskellige TGIRT-enzymer, standsede en (GsI-IIC RT eller TGIRT-III, Fig. 3, B) stadig ved 15 nukleotider fra starten af ​​tRNA, mens den anden (TeI4c RT, fig. 3, C) – nr. Derfor kom forskerne til den konklusion, at den eksosomale tRNA i denne stilling indeholder et nukleotid med en ukendt modifikation. Dette nucleotid kunne være dihydrouridin, hvilket er ret almindeligt for D-sløjfen af ​​tRNA. To observationer taler imod dette: For det første er det kendt, at TGIRT-enzymer nemt kan læse dihydrouridin, og for det andet observeres ikke stoppene for 15 nucleotider i tilfælde af intracellulært tRNA.

Fig. 3. En – struktur af tRNA, der viser D-, T- og anticodon-sløjfer 5 'betyder begyndelsen af ​​molekylet, 3' – dens ende. Den omtrentlige position af nukleotidet med en ukendt modifikation er vist rød knust linje. B og C – distribution af længderne af tRNA-sekvenser efter sekventering af RNA ved anvendelse af to termostabile revers transkriptaser – GsI-IIC RT (også kendt som TGIRT-III) og TeI4c RT. Ved sekventering af cellulært RNA (Hele celler, blå grafika) alle sekvenser svarer til fuld længde-tRNA (top fuld længde) uanset typen af ​​revers transkriptase. På samme tid, når sekvensering af exosomalt RNA (eksosomer, rød linje) GsI-IIC RT stopper 15 nukleotider før starten af ​​tRNA (graf B, top tRNA *) og TeI4c RT-no (revers transkription forekommer fra slutningen af ​​RNA molekylet (3 ') til dets begyndelse (5')). Figur fra den diskuterede artikel i PNAS

Det viser sig at kun exosomalt tRNA har en sådan modifikation, og dette er ikke dihydrouridin, men noget helt nyt. Det er vigtigt at understrege, at denne modifikation ikke er til stede i intracellulær RNA. Herved kan det følges, at alle tRNA'er med en sådan modifikation automatisk sendes til eksosomer. Samtidig udelukker forfatterne ikke mulighedenat nukleotidmodifikationen i denne position sker direkte i eksosomerne! Hvorvidt denne modifikation er en betingelse eller resultatet af at placere tRNA i eksosomer, vil blive vist ved yderligere undersøgelser.

Faktisk er det ikke overraskende, at RNA i exosomer ikke er fragmenteret. Dobbelt lipidlaget beskytter pålideligt exosomalt RNA fra alt i det ekstracellulære rum, herunder forskellige RNA-nedbrydende enzymer (RNaser). Interessant nok, hvis du tilføjer et lille opløsningsmiddel til exosompræparatet for at bryde integriteten af ​​deres lipidmembraner og således tillader de tilsatte RNaser at komme ind, sker den fuldstændige ødelæggelse af alle exosomale RNA stadig ikke. Så for eksempel var RNY3-, VTRNA1-1-, C / D-boks lille nukleolært RNA, 5S rRNA og U5 RNA resistent over for sådan behandling. Forfatterne konkluderede, at disse RNA'er er placeret i eksosomer i sammensætningen af ​​ribonukleoproteinkomplekser, der beskytter dem mod RNaser. Samtidig er de resterende RNA sandsynligvis i fri tilstand inde i exosomer, og de biologiske årsager til dette er stadig et mysterium.

Lang RNA i eksosomer – relativt kort

Mange sekvenser opnået ved RNA-sekventering synes at være resultatet af tilstedeværelsen af ​​DNA-kontaminering af exosompræparater.Ved hjælp af forskellige kombinationer af behandlinger med opløsningsmiddel, proteaser (for at ødelægge proteiner) og nucleaser (for at ødelægge RNA eller DNA) viste forfatterne, at DNA faktisk kan "holde fast" på overfladen af ​​exosomer udenfor. Om dette er et biologisk vigtigt fænomen eller en artefakt af protokollen til opnåelse af eksosomer, er det endnu ikke klart. Tilstedeværelsen af ​​DNA-forurening kan manifestere sig, for eksempel i nærvær i resultaterne af RNA-sekventering af intron-sekvenser fra proteinkodende gener.

Behandling af lægemidlet med exosomer med DNase fik lov til at slippe af med DNA-artefakter og for at sikre, at nogle transkripter af proteinkodende gener faktisk findes i eksosomer. Det er bemærkelsesværdigt, at de fleste exosomale mRNA'er er kortere end 1500 nukleotider i længden, hvilket ikke er overraskende, hvis vi husker at eksosomer er meget små vesikler. Blandt mRNA'erne er de mest almindelige dem, der koder ribosomale proteiner eller andre proteiner involveret i oversættelse. Disse mRNA'er indeholder 5'-terminale oligopyrimidin-sekvenser (5'-terminale oligopyrimidin, 5 'TOP), som giver dig mulighed for at koordinere disse transkripter på en koordineret måde på tidspunktet for deres oversættelse.Forskere mener, at dette er en potentiel sammenhæng mellem meddelelserne i exosomerne og den cellulære metabolisme af både de udskillende og modtagende exosomceller.

Eksosomer Eksempler på renhed

Det, hvor lidt vi ved om ekstracellulære vesikler, illustrerer godt: vi har stadig ikke kommet til et kompromis om den optimale metode til isolering og rensning. Alle de metoder, der anvendes i dag, har både udtalte fordele og betydelige ulemper. At finde den optimale metode er særlig vigtig, fordi det ekstracellulære rum indeholder en enorm mængde RNA forbundet med forskellige proteiner. Disse komplekser kan signifikant forurense præparaterne af ekstracellulære vesikler, og som et resultat præparater af deres RNA.

Heldigvis henvendte forskerne også dette problem fuldt væbnede. For det første koncentrerede de sig om en subpopulation af ekstracellulære vesikler – CD63+-ekzosomah. Desuden anvendte de triple rensning af exosomer ved anvendelse af ultracentrifugering med en acceleration på 100.000 g, en sucrose gradient og udvælgelse med antistoffer (figur 4). Centrifugering med stor acceleration præcipiterer ekstracellulære vesikler, adskiller dem efter vægt fra de fleste proteinkomplekser, der forurener præparatet (se fig. 1, A).Derefter anbringes ekstracellulære vesikler i en 60% saccharoseopløsning, og tre lag sukkrose med lavere koncentrationer (40%, 20% og 0%) påføres ovenpå den. Når centrifugeret på grund af dens densitet (1,15-1,19 g / ml) flyder exosomer til grænsefladen af ​​saccharoselag med koncentrationer på 40% og 20%. I sluttrinnet er en delmængde af exosomer indeholdende den i membranerne indfanget fra det ekstracellulære vesikelpræparat ved hjælp af antistoffer mod tetraspanin CD63.

Fig. 4. Skemaet beskrevet i artiklen om rensningen af ​​de ekstracellulære lægemidler. Mediumet af HEK293T-celler indeholdende ekstracellulære vesikler blev udsat for flere runder centrifugering, hvorefter bundfaldet blev adskilt fra proteinkontaminanter under anvendelse af en sucrosegradient. Fra det således opnåede oprensede ekstracellulære vesikelpræparat blev yderligere CD63 oprenset+exosomer og deres RNA for TGIRT-seq. Billede fra artiklen i diskussion PNAS

En sådan grundig tilgang tyder på, at lægemiddeleksosomet, der præsenteres i artiklen under drøftelse, måske er en af ​​de reneste af dem, der er beskrevet i litteraturen i øjeblikket, og informationerne opnået af forfatterne om sammensætningen og sorteringsmekanismen af ​​exosomalt RNA er et stort skridt i retning af en bedre forståelse af funktionerne af exosomer og ekstracellulære vesikler overhovedet.Ikke desto mindre ved vi ikke, om alle exosomer indeholder tetraspanin CD63 og om det er en del af mikrofibermembranen. Spørgsmålet om at opnå alle exosomer, der ikke er forurenet med andre typer af vesikler (og ikke deres subpopulationer) forbliver således åbne.

Hvordan kommer RNA ind i exosomer? Som med mange spørgsmål om eksosomer (og ekstracellulære vesikler generelt) er der mange forskellige studier, der forsøger at besvare dette spørgsmål ved hjælp af eksempler på individuelle RNA'er. Men indtil dette punkt blev der ikke afledt mønstre. Forfatterne hævder, at i tilfælde af korte RNA'er sker dette ved hjælp af YBX1-proteinet, som også er til stede i exosomerne, selvom mekanismen for dets operation endnu ikke er klar. Så, tRNA, Y-RNA og Vault RNA akkumuleret i YBX1 knockout celler uden at indtaste deres eksosomer. Det er kendt, at ekspressionsniveauerne af YBX1 er forhøjet i tumorer. Det kan være svært at tro, men vi ved, at ekstracellulære vesikler fra tumorer kan omdanne en normal celle til en cancercelle (M. A. Antonyak et al., 2011.). I dette tilfælde kan YBX1's rolle i intercellulær kommunikation og regulering af tumormikromiljøet være meget vigtigt.Samtidig er det uklart, hvordan mRNA falder ind i exosomer, da knockout af YBX1 ikke påvirker deres tilstedeværelse i eksosomer.

Hvad har vi til sidst? I ekstracellulære vesikler repræsenteres RNA ved fuld længde, kort, ikke-kodende RNA. De fleste af dem er tRNA; de har en tydelig ændring i D-loop, hvilket cellulært tRNA ikke har. Det er vigtigt, at korte RNA'er er sorteret i exosomer ved hjælp af et specielt protein YBX1. Alt dette vidner for hypotesen om, at exosomer (og højst sandsynligt andre ekstracellulære vesikler) ikke kun er "poser med cellulære affald". Det er mere sandsynligt, at disse er omhyggeligt opsamlet pakker fra nogle celler til andre. Ikke desto mindre afviser forfatterne ikke muligheden for, at YBX1 binder specifikt til beskadigede, ikke-funktionelle eller simpelthen rigelige, korte ikke-kodende RNA'er og sender dem til eksosomer, hvis de ikke er forbundet med deres normale proteinpartnere. RNA i eksosomer kan så rejse til andre celler, komplementere eller regulere deres metabolisme eller forårsage cellulære immunitetsreaktioner.

Hvis du har detaljerede instruktioner til montering, siger en bil, så vil du muligvis forstå sin enhed.Men hvad nu hvis du ikke har hele instruktionen, men kun tilfældige fragmenter af sine sider? Uventet fandt de fleste forskere, der studerede ekstracellulære vesikler, sig i en anden situation. Dette skyldes det faktum, at ifølge tidligere offentliggjorte eksperimentelle data blev det antaget, at det genetiske materiale i ekstracellulære vesikler (hovedsageligt kort RNA) er i en fragmenteret tilstand. Nu har vi ikke kun detaljerede, komplette instruktioner til montering af en bil, men også et værktøj til tuning (YBX1-afhængig sortering).

Kilde af: Matthew J. Shurtleff, Jun Yao, Yidan Qin, Ryan M. Nottingham, Morayma M. Temoche-Diaz, Randy Schekman og Alan M. Lambowitz. Definer den lille, ikke-kodende RNA-sammensætning af exosomer // PNAS. 2017. DOI: 10.1073 / pnas.1712108114.

Se også:
Sybren, L. N. Maas, Xandra O. Breakefield, Alissa M. Weaver. Ekstracellulære vesikler: Unikke Intercellulære Delivery Vehicles // Trends in Cell Biology. 2017. DOI: 10,1016 / j.tcb.2016.11.003.

Dinar Yunusov


Like this post? Please share to your friends:
Skriv et svar

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: